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第一节农药残留的快速检测第二节兽药残留的快速检测第三节真菌毒素及化学污染物的快速检测第四节致病微生物的快速检测第五节食品中异物的检测方法第二章食品中有毒有害物质的快速检测方法一、何为快速检测快速检测没有经典的定义，而是一种约定俗成的概念，即：包括样品制备在内，能够在短时间内出据检测结果的行为称之为快速检测。二、快速检测的时间概念理化快速检验方法：包括样品制备在内，能够在两小时以内出具检测结果，即可视为实验室快速检测方法。如果方法能够应用于现场，在30分钟内出具检测结果，即可视为现场快速检测方法。如果能够在10几分钟甚至几分钟内得到检测结果，可视其为比较理想的现场快速检测方法。微生物快速检验方法：与传统检验方法相比，能够缩短1/2或1/3的检测时间，就可得到检测结果,可视为快速检测方法。第一节农药残留的快速检测农药是指用于消灭、控制危害农作物的害虫、病菌、鼠类、杂草、及其它有害动植物和调节植物生长的药物。按用途分九种：杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、杀菌剂、除草剂、脱叶剂、植物生长调节剂。农药残留：农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、毒代谢物、降解物和杂质的总称，残存的数量称残留量，一般以每千克中有多少毫克表示。农药残留量是施药后的必然现象，但如果超过最大残留量，对人畜产生不良影响或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害，则称为农药残留毒性（简称残毒）。目前，我国农药残留较为突出的是蔬菜中的农药残留问题。近年来蔬菜被农药污染的情况有增无减，有机磷农药残留尤为突出。有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯：对硫磷（1605）、内吸磷（1059）、马拉硫磷（4049）、乐果、敌百虫、敌敌畏。控制蔬菜中农药残留对人体的危害，最为有效的方法之一是加强对蔬菜中的农药残留检测的力度。传统的农药分析主要依赖于气相或液相色谱等仪器，仪器分析虽然可以检出样品中较微量的农药，但操作复杂、费时费工、检测成本较高。农药残留快速测定方法从反应原理上分为生物法和化学法。生物法:活体生物测定法:使用发光细菌或敏感性家蝇作为测定材料。分子生物学方法:采用免疫反应如酶联免疫反应。生物化学测定法:利用胆碱酯酶抑制原理。农药残留快速测定法从仪器使用上分为：气相色谱仪法液相色谱仪法农药残留分光光度法(抑制率法)目视法(如有机磷农药速测灵法、农药残留试纸法、酶片法)。一、免疫分析技术常用于农药残留分析的免疫分析技术有：酶免疫技术放射免疫技术RIAEIA1.放射免疫技术放射免疫技术是以放射性同位素为标记物的标记免疫分析法,用于定量测定受检标本中的抗原或抗体。基本原理是：采用定量的标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对有限量特异性抗体(Ab)的竞争结合反应。结合型的标记抗原Ag*-Ab(B)游离型标记抗原Ag*(F)放射免疫分析法的原理与方法先将放射性同位素标记已知抗原或抗体，与待检标本反应后，用γ射线探测仪或闪烁计算器测定γ射线或β射线的放射性强度，根据放射性强度计算标本中抗原或抗体的含量。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达10pg水平。常用于标记的同位素有8H、125I和3H。测定方法与步骤(1)抗原抗体反应：平衡法。(2)分离结合与游离标记物沉淀剂沉淀复合物，离心分离。(3)放射性测定及数据处理晶体闪烁计数仪(γ射线)或液体闪烁计数仪(β射线)绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。β液闪仪γ计数器但是由于放射免疫分析法需要较昂贵的液体闪烁仪或放射仪，且放射性同位素对工作人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些不利因素限制了该法的广泛应用。2.酶免疫技术(EIA)酶免疫技术是用酶标记的已知抗原或抗体，检测标本中的相应抗体或抗原，将抗原抗体反应的特异性与酶催化反应的专一性相结合的免疫检测技术。酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA）酶联免疫吸附法是把抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫检测技术。将已知抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯板)上进行酶免疫反应，检测相应的抗体或抗原。应用：食品中毒素的测定、食品有害微生物的快速检测、食品中农药残留的检测、食品中抗生素残留的检测（如氯霉素）ELISA基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。ELISA原理图ELISA基本的实验过程ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物ELISA的一般操作方法固相载体的准备：最常用的是聚苯乙烯微量反应板，规格有40孔、72孔、96孔，板孔呈凹型，应用方便。抗原或抗体的包被：将Ag或Ab吸附到固相载体的过程称为包被。固相载体的封闭：固相载体包被Ag(或Ab)后，载体表面可能因残留未吸附蛋白质的活性部位而吸附抗体或酶标抗体，引起试验误差；因此需事先用含0.5％BSA-0.05％吐温-20的PBS封闭30～60分钟（37℃），以降低非特异性吸附。固相载体的洗涤：洗涤是在整个酶联免疫吸附测定的操作过程中不可缺少的一个步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体板，目的在于防止重叠反应引起的非特异性吸附。---常用的洗涤液为：0.02M，pH7.2(或7.4)的PBS(含NaCl0.15M，0.05％吐温-20)；洗涤时先将加入的反应液倒干，然后加洗涤液于孔中，泡洗3分钟，重复3次，最后倾去洗涤液，用吸水纸吸干。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。方法：先将已知抗体吸附在固相载体上，加入待检抗原，再加入酶标记的已知抗体，反应后形成“抗体-抗原-酶标抗体”复合物，最后加入酶的底物显色。应用：常用于检验各种蛋白质等大分子抗原。适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。双抗体夹心法双抗体夹心法测抗原+-EEEEEEEEE原理为标本中的抗原(抗体)和一定量的酶标抗原(抗体)竞争与固相抗体(抗原)结合。方法：用已知抗体(抗原)包被，加入待测血清，再加酶标抗原(抗体)，酶标抗原(抗体)与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：可用于测定抗原和半抗原，也可用于测定抗体。竞争法竞争法测抗原+-EEEEEEE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合E原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。方法：先将已知抗原吸附在固相载体上，加入待检血清，再加入酶标记的抗抗体，反应后形成“抗原-抗体-酶标抗抗体”复合物，最后加入酶的底物显色。优点：一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用：主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法底物显色：必须用反应后能形成水溶溶性色素的供氢体，常用的有邻苯二胺(CPD)，联苯茴香胺，5-氨基水杨酸和邻联甲苯胺。于用前配制避光保存，加入反应孔作用20～30min。显色终止：阴性对照孔微微出现颜色，加入终止液（2MH2SO4）结果判定：在白色背景上，用肉眼观察，每批试验均需有阴性对照。颜色反应明显深于对照组者判为阳性。酶标仪测定，待检孔OD值(P)与对照孔OD值(N)的比值(P/N)大于1.5或2.0者为阳性。定量测定：对于抗原的定量测定（如酶标记抗原竞争法），需事先用标准抗原制备一条吸收值与浓度的相关标准曲线，只要测出样品的吸收值，即可查出其抗原浓度。优点:①可以通过颜色来快速做定性结果分析;②特异性强;③灵敏度高;④酶标板上一次可作多份样品检测。标记酶要求很高，应具备:①纯度高、溶解性高、特异性强、稳定性高;②测定方法应简单、敏感、快速;③与底物作用后会呈现颜色;④与抗体交联后，仍保持酶的活性。最常用的是辣根过氧化物酶(HRP)，它广泛存在于植物界，辣根中的含量尤高。HRP是一种糖蛋白，由酶蛋白和铁啉结合而成，相对分子质量为40000，其底物是二氨基联苯胺(DAB)，DAB经酶解可产生棕褐色沉淀物。因而可用目测或用比色法测定。还有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和β-D-半乳糖苷酶等可供应用。3.RIA和EIA技术异同点相同点：1)RIA与EIA技术的原理基本一致，即抗原与抗体反应，形成抗原一抗体复合物。2)RIA与EIA检测技术都是由反应系统和检测系统组成，不同点：1)RIA技术以放射性同位素作指示剂(标记物)；而在EIA技术中，用作标记物的指示剂为生物酶。2)RIA技术操作过程中检测放射性同位素需要昂贵的仪器设备和防辐射设备，并且需要专业人员。相对于RIA技术而言，EIA技术有更多的优点，如灵敏度高、特异性强、成本低、简便快速、自动化程度高、检测方法多样和安全等。因此，EIA技术，尤其是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)，已成为目前使用最普及的免疫分析技术。目前，国外已研制出几十种农药的酶免疫检测试剂盒，包括有机磷类、氦基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及酰胺类等。美国使用的ELISA试剂盒对有机磷农药普遍的最小检出浓度达20pg/kg，对氨基甲酸酯类农药普遍的最小检出浓度达300ug/kg。免疫检测试剂盒使用起来简便、快速，操作人员不需经过特殊培训，样品不需净化或只需简单的净化。二、生物化学测定法生物化学测定法包括农药速测卡法、农药速测片法、农药残留分光光度计法。运用胆碱酯酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的一种快速现场检测方法。农药残留速测仪1.农药速测卡法农药速测卡法又称农药残留试纸法、酶试纸法。原理：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸靛酚(蓝色)，有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。蔬菜表面测定法（粗筛法）：擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。放置10min进行预反应，将速测卡对折后，用手捏3min时，打开与空白对照实验卡比较判定。分析步骤：蔬菜整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL浸提液，震摇50次，静置2min以上。取2～3滴浸提液滴在速测卡上，以下操作与表面测定法相同。饮用水中污染农药的检测：直接取2～3滴加到速测卡上进行操作。中毒残留物中农药的检测：取样品适量于容器中，加入2倍量的乙酸乙酯，充分震摇后静置，取澄清液于蒸发皿中，在水浴上蒸干乙酸乙酯，取1mL磷酸盐浸提液溶解蒸干后的残渣，取残渣溶液2～3滴于速测卡白色药片上进行检测。结果判定：判定结论判定依据强阳性结果速测卡白色药片不变色，说明农药残留量较高弱阳性结果速测卡白色药片显浅蓝色，说明农药残留量相对较低阴性结果速测卡白色药片显天蓝色或与空白对照卡相同速测卡法测定结果与空白对照卡比较2.农药残留分光光度计法又称抑制率法。利用胆碱酯酶原理。在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关系。如果样本提取液中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试验中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色变化很小;如果样本提取液中不含有机磷和氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制