12免疫荧光技术

免疫荧光技术制片人兼主讲人：苏士龙艾克热木目录免疫荧光技术的简介技术特点原理技术分类常见荧光荧光产生及特性实验方法其他免疫荧光技术免疫荧光技术的简介Coons等人于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。[1]用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。肌细胞免疫荧光技术优缺点优点：1.特异性强2.敏感性高3.速度快主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应技术分类⑴荧光抗体技术抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。⑵免疫荧光测定抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法常见荧光荧光素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料.例如：异硫氰酸荧光素四乙基罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明酶作用生物质酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如：4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用荧光的产生及特性物质吸收外界能量进入激发状态，再回到稳定基态时，多余的能量会以电磁辐射的形式释放，即发出荧光，这类物质被称为荧光素。特性：1.停止供能，荧光现象随即终止2.对光的吸收和荧光的发射具有高度的选择性发射光的波长入射光的波长合适荧光素的选择1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光素-N=C+NH-蛋白质→荧光素-N-C-N-蛋白质2）荧光效率高，标记后下降不明显。3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。4）标记后能保持生物学活性和免疫活性5）标记方法简单、快速6）安全无毒实验方法直接法间接法补体法其他直接法将荧光标记的特异抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗—干燥—封片—镜检操作简便，特异性高，非特异性染色少敏感性低间接法先用已知为标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原—抗体—抗体复合物，水洗—干燥—封片—镜检补体法利用补体反应通过形成抗原—抗体—补体复合物发射荧光补体反应可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。免疫荧光技术应用1.用做细菌，病毒和寄生虫的检验2.用做检测自身抗体，在自身免疫病的实验诊断中应用广泛3.间接免疫荧光技术可用于检测血清中的抗体，用于流行病学调查和临床回顾诊断。其他免疫荧光技术时间分辨荧光免疫分析荧光偏振免疫分析技术时间分辨荧光免疫测定利用具有双功能集团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测无含量时间分辨荧光免疫测定的特点采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的疝灯），照射样品后即短暂的熄灭以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测镧系荧光镧系荧光具有较长的荧光寿命，延缓测量时间，能有效的消除非特异本底荧光（10n）的干扰镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差异，有利于排除非特异性荧光干扰，提高检测特异性。荧光偏振免疫分析技术利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术。