微流体数字化技术制备基因芯片微阵列

第１９卷　第６期２０１１年６月　　　　　　　　　　　光学精密工程　ＯｐｔｉｃｓａｎｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　　　　　　Ｖｏｌ．１９　Ｎｏ．６　Ｊｕｎ．２０１１　　收稿日期：２０１０１２２７；修订日期：２０１１０３０７．　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．５０９７５１５２）；南京理工大学自主科研专项计划资助项目（Ｎｏ．２０１０ＧＪＰＹ００６）；教育部博士学科点专项科研基金资助项目（Ｎｏ．２００６０２８８００５）文章编号　１００４９２４Ｘ（２０１１）０６１３４４０９微流体数字化技术制备基因芯片微阵列耿　鑫，侯丽雅，杨　眉，王洪成，章维一（南京理工大学机械工程学院，江苏南京２１００９４）摘要：采用以脉冲为微流动基本形态、脉冲当地惯性力为主动力的微流体数字化技术进行了基因芯片微阵列制备实验。在搭建的基于微流体数字化技术的基因芯片微阵列制备系统上，实验验证了脉冲点样系统参量（收敛角２θ、微喷嘴内径犱、电压幅值犝和驱动频率犳）对样点直径和脉冲点样稳定性的影响规律。以实验规律为依据，提出了制备样点直径约为１００μｍ的中等密度微阵列的实验路线，制备出了样点平均直径为１０２．２μｍ、微阵列密度约为４０００ｓｐｏｔ／ｃｍ２的基因芯片微阵列（点样溶液为３×ＳＳＣ柠檬酸盐缓冲液）。得到的研究结果可为建立高密度基因芯片脉冲点样技术提供实验研究基础。关　键　词：微流体数字化；脉冲点样；基因芯片微阵列中图分类号：Ｑ８１９；ＴＰ２７３　　文献标识码：Ａ　　犱狅犻：１０．３７８８／ＯＰＥ．２０１１１９０６．１３４４犘狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀犲犮犺犻狆犿犻犮狉狅犪狉狉犪狔狊狌狊犻狀犵犿犻犮狉狅犳犾狌犻犱犱犻犵犻狋犪犾犻狕犪狋犻狅狀ＧＥＮＧＸｉｎ，ＨＯＵＬｉｙａ，ＹＡＮＧＭｅｉ，ＷＡＮＧＨｏｎｇｃｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧＷｅｉｙｉ（犛犮犺狅狅犾狅犳犕犲犮犺犪狀犻犮犪犾犈狀犵狀犲犲狉犻狀犵，犖犪狀犼犻狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犖犪狀犼犻狀犵２１００９４，犆犺犻狀犪）犆狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉，犈犿犪犻犾：犺狅狌犾犻狔犪＠犺狅狋犿犪犻犾．犮狅犿犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｇｅｎｅｃｈｉｐｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｔｈｅｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｄｉｇｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅｐｕｌｓｅｉｓｂａｓｉｓｆｏｒｍｓｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｆｌｏｗｓａｎｄｔｈｅｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｆｌｏｗｓａｒｅｄｒｉｖｅｎｂｙｔｈｅｐｕｌｓｅｄｌｏｃａｌｉｎｅｒｔｉａｆｏｒｃｅｉｎｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｙｓｔｅｍｔｏｐｒｅｐａｒｅｇｅｎｅｃｈｉｐｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｗａｓｂｕｉｌｔｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｔｈｅｎｏｚｚｌｅｉｎｓｉｄｅｆａｌｌｏｆｆａｎｇｌｅ２θ，ｎｏｚｚｌｅｉｎｎｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ犱，ｖｏｌｔａｇｅａｍｐｌｉｔｕｄｅ犝，ａｎｄｔｈｅｄｒｉｖｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｃｙ犳ｏｎｔｈｅｄｒｏｐｌｅｔｄｉａｍｅｔｅｒａｎｄｐｕｌｓｅｐｏｔｔｉｎｇｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｃｈｅｍｅｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｔｈｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｗａｓｐｒｏｐｏｓｅｄａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｍｏｄｅｒａｔｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｗｉｔｈｔｈｅｄｒｏｐｌｅｔａｖｅｒａｇｅｄｉａｍｅｔｅｒｏｆ１０２．２μｍａｎｄｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏａｒｒａｙｏｆ４０００ｓｐｏｔ／ｃｍ２ｗｅｒｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇ３×ＳＳＣｃｉｔｒａｔｅｂｕｆｆｅｒａｓｓｐｏｔｔｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｂａｓｉｓｆｏｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇａｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｍｉｃｒｏａｒｒａｙｐｕｌｓｅｓｐｏｔｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｄｉｇｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｐｕｌｓｅｓｐｏｔｔｉｎｇ；ｇｅｎｅｃｈｉｐｍｉｃｒｏａｒｒａｙ１　引　言　　基因芯片技术发展于２０世纪９０年代，是一种能够对大量遗传信息进行快速、高通量、并行检测的多学科交叉融合技术［１３］，在生物检测、医学检验和药物筛选等［４６］众多领域得到了广泛应用。根据制备方式，基因芯片可分为高密度的原位合成芯片和中、低密度的ＤＮＡ微阵列两大类。在实际临床诊断及军事、司法应用中，大多情况下只需要简单灵活、速度快、成本低、易于操作、质量可靠的中、低密度ＤＮＡ微阵列制备技术［２］。中、低密度微阵列点样技术分为接触式和非接触式两种，由于非接触式点样具有样品点定量准确、重现性好等优势，被作为主要点样技术采用。现有的非接触式点样技术按照驱动方式可分为气压驱动、热空气驱动、静电驱动、容积式压电驱动和压力驱动等［７］。气压驱动以ＪｅｎｓＤｕｃｒｅｅ等人提出的ＴｏｐＳｐｏｔＴＭ技术，以及ＰｅｔｅｒＫｏｌｔａｙ等人提出的一种基于Ｓｉ的ＤＷＰＴＭ（ＤｉｓｐｅｎｓｉｎｇＷｅｌｌＰｌａｔｅ）系列样品分配装置为代表［８９］。气压驱动具有操作和制备工艺简单等优点，但存在着外接驱动设备庞大，无法与微喷阵列芯片集成的问题；同时由于气压大小无法精确控制和喷射过程中会产生负压等原因，微喷头内部易产生气泡影响喷射质量。热空气驱动［１０］虽然已成功应用到打印机技术中，但其制作工艺过于复杂，同时长期发热会影响生物样品活性，因而大大限制了其在生物领域中的应用前景。静电驱动［１１］是通过静电力使液体腔膜片发生形变，驱动液滴微喷射。静电驱动的制造及装配工艺都比较复杂。容积式压电驱动［１２１３］的关键组成部分是液体腔，液体腔的一侧或两侧由压电陶瓷片组成。工作时，压电陶瓷片在外加电场的作用下，做厚度切变振动，从而改变液体腔的体积，同时产生一个足够大的沿喷孔方向的正压力波，该压力波足以克服喷孔内壁黏附以及表面张力，使液体从喷孔喷出。已成为产品的容积式压电驱动点样仪的微喷嘴由金属材料经精密机械加工而成，成本较高。同时，该方法对喷射液体的物理性质要求较高，难以喷射黏稠度较大的液体。通常的解决办法是对微喷嘴腔体进行加热，但会造成点样液变性，所以对热敏感的样品无法进行点样。机械压力驱动［１４］机理与容积式压电驱动相似。微流体数字化技术（也称微流体脉冲驱动控制技术）以脉冲流动为微流动基本形态，以脉冲当地惯性力为主动力，适用于各种液体和粉体，液体喷射量分辨率可达飞升级［１５１８］。脉冲惯性力可通过不同方式产生，压电器件具有电压位移动态响应好、响应频率高等特点，可作为整体驱动器置于微流道外部产生脉冲惯性力，而压电器件驱动电压的输入波形、幅值、频率等可作为微流体脉冲（数字化）流动的驱动控制参量［１６］。近年来，南京理工大学微系统研究室对微流体数字化技术在细胞基因工程的应用及相应微流体器件制备上展开了研究［１９２１］，在文献［２０］中，利用压电陶瓷器件作为脉冲惯性力的动力源，制备了中等密度的液滴微阵列，液滴圆整，均一性良好，为用微流体数字化技术制备基因芯片微阵列打下了实验基础。本文在文献［２０］的研究基础上，将微流体数字化技术应用于基因芯片制备技术中。通过对基因芯片脉冲点样的实验研究，探索微流体驱动控制参量、点样微喷嘴的几何尺寸等对样点直径和脉冲点样稳定性的影响规律，并根据建立的影响规律制备中等密度的基因芯片微阵列。由于微流体数字化技术具有液体喷射量分辨率高的优势［１５１７］，本文的研究方法可为微流体数字化技术制备高密度基因芯片探索新途径。２　基因芯片微阵列制备实验系统　　如图１所示，基因芯片微阵列制备系统主要由计算机、压电驱动控制系统、压电陶瓷作动器、三维调节架、二维工作台及其运动控制器、频闪观测仪、微喷嘴和玻璃基片等组成。微流体数字化技术中使用的压电器件为堆栈式压电陶瓷作动器（不同于容积式压电驱动中的压电陶瓷片），压电陶瓷作动器安装在流路本体外部，压电驱动控制系统输出的电压波形信号加载在压电陶瓷作动器两端，使微喷嘴内的液体获得足够大的惯性力，克服黏性力从微喷嘴中喷出。基因芯片微阵列制备过程中，计算机（上位机）通过ＲＳ２３２串口通信同时给压电驱动控制系统（下位机）和二维工作台运动控制器（下位机）５４３１第６期　　　　　　耿　鑫，等：微流体数字化技术制备基因芯片微阵列图１　基因芯片微阵列制备实验系统Ｆｉｇ．１　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｇｅｎｅｃｈｉｐｍｉｃｒｏａｒｒａｙ发送指令，使压电陶瓷作动器和二维工作台协调工作。本文使用的压电陶瓷作动器为德国ＰＩ公司生产的Ｐ８４４．１０型压电陶瓷，电压为０～１００Ｖ，位移为０～１５μｍ；微流体驱动控制参量是指压电驱动控制系统提供给压电器件的驱动电压波形（驱动波形）、驱动电压幅值（电压幅值犝）和驱动电压频率（驱动频率犳）。微喷嘴是基因芯片微阵列制备的核心器件，材料为硼硅酸盐玻璃毛细管（规格：内径０．６ｍｍ，外径１．０ｍｍ），由南京理工大学微系统研究室自制锻制仪［１７］锻制而成。图２为锻制成型内径犱为５０μｍ的玻璃微喷嘴显微照片。图２中２θ为微喷嘴的收敛角，可由下式估算：θ＝ａｒｃｔａｎ犇－犱２（）犔，（１）式中，犇为玻璃毛细管锻制前的内径；犱为锻制后图２　微喷嘴显微照片Ｆｉｇ．２　Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｏｆｍｉｃｒｏｎｏｚｚｌｅ的微喷嘴的内径；犔为玻璃毛细管的变形长度。　　由于制备基因芯片微阵列所用的生物样品大多比较昂贵，本文在实验阶段采用的样品溶液为用来溶解高黏度ＰＣＲ产物和基因组ＤＮＡ的标准柠檬酸盐缓冲液（３×ＳＳＣ）。实际生物样品溶液的黏度一般都由其缓冲液的黏度决定，因此，可以用缓冲液代替实际生物样品溶液进行基因芯片微阵列制备的实验研究，以节约实验成本［２２］。３　基因芯片微阵列制备实验３．１　基因芯片微阵列评价指标基因芯片微阵列制备技术的主要评价指标有：容量，密度，样品点尺度、纯度、活性，规整度，通量，可操作性等［２２］。其中，样品点尺度、密度是重要指标，决定着微阵列荧光检测和数据分析的难易程度。因此，本文选取样品点尺度和密度作为基因芯片微阵列制备质量的评价指标，具体说明如下：样品点尺度：指微阵列样品点的大小，一般用样品点直径表示，接触式和非接触式点样设备多为容积式压电驱动，制备的样品点尺度在７５～３００μｍ。本文采用样品点直径犇犱表示样品点尺度，测量方法为：将液滴喷点在表面平整、经疏水化处理后的玻璃基片上，样点在表面张力的作用下，形成规则的圆形，通过显微测量系统测出样点直径的大小。微阵列密度：指基片（实验系统中的玻璃基片）内单位面积内的样品点数（单位：ｓｐｏｔ／ｃｍ２），可通过下式计算：犇＝１００×１０００（）狊２，（２）式中：犇为单位面积的样品点数，狊为相邻样品点的中心间距（单位：μｍ），一般选为样品点直径犇犱的１．２～１．６倍。本文设计的基因芯片微阵列制备实验系统中，通过改变二维工作台的运行参数对狊进行设定。３．２　微阵列制备系统参量对样点直径和脉冲点样稳定性的影响影响微阵列样点直径和脉冲点样稳定性的因素很多，可分为驱动控制参量（驱动波形、电压幅６４３１　　　　　光学　精密工程　　　　　第１９卷　值犝、驱动频率犳）、几何参量（微喷嘴内径犱和微喷嘴收敛角２θ）和点样液物性（黏度），驱动控制参量和几何参量统称为系统参量。本文将系统参量中驱动波形固定为常用的基础波形———矩形波，主要研究收敛角２θ、微喷嘴内径犱、电压幅值犝和驱动频率犳对样点直径犇犱和脉冲点样稳定性的影响规律。电压幅值犝与驱动频率犳由计算机（上位机）程序设置，变化范围分别为０～８０Ｖ和０～２５６Ｈｚ。微喷嘴内径犱可选范围为１５～２００μｍ，微喷嘴至玻璃基片的高度为２．０ｍｍ。点样液为３×ＳＳＣ，使用乌氏黏度计测量出黏度为１．２８ｍｍ２／ｓ（黏度计常数：０．１０９９ｍｍ