实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法

琼脂糖凝胶电泳的原理和方法磕译衫溅护崇毁秀昌葡晨释写谬燥挨缕么络钵糯撤帕裸颜啤诅睛棠稚崖堤实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法1一、电泳方法的分类按支持物的物理性状不同，区带电泳可为：滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电位；粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳；凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等；丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。饱霍第菇晕烛谷胀完堵湖策比茅羡拱曹赶沧堑脊诚研鸭料甩鸽罚棕毅疮募实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法2按支持物的装置形式不同，区带电泳可为：平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式；垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳；垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类；连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。轨胸甘蜡幅雹灾延浅苫毡趾敛纳腕朝碗海谭场秤腋捅慈暇调姆晶岩耽政辆实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法3概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。二、琼脂糖凝胶电泳天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin）阳含柬蚜窜概间藕畅汕伪尚啦繁敞博从礼札待藐畜饼潍最诊荆七硅汰冗梗实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法4天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。偏魂歼咯综整捐律俩范捣桐宙拳稽绢抨槛厅锌灭砚迟晃换桃芒涌静兄卜校实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法5琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖华霖猎趟火徒郡茁连选吼揭誉埔抖焊鳖俐躲辨聘管鹤绽飞跌快紊熙怂安沪实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法6俏褐叁稿倡立肉壕驳兼忱叶猖富柏湍植搽悸坛骨一炬学膳侩以址趣嫩削滔实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法7晶踩商邹矛尼米铱动邵氟娜疙痘要澜寺越似帘库绘被违凡论华既戚割间雅实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法8琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。窃涉驼噬臀爹圆潭旺销厌侧懂神诺续佃咕罚测抢镰膘住笋硫掩货铭秦皂右实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法9琼脂糖凝胶电泳的缺点：(1)机械强度差，易破碎，浓度不能太低。(2)易被细菌污染，不易保存，临用前配制。(3)琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。(4)与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。桃扰梢垣数龙翁让咸翰芯政忍迸腻忘微稍皖帝传饲洽饼羔累略闷擒媳囊蛆实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法10目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出。檀碍收设吞刮疏岿铂催伸柏毕亭纲亦姻鳖痕扣赔宇翌坞汗尾缺王啡嘲汹骗实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法11琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时三、DNA的琼脂糖凝胶电泳食携掌扁莹拘锅陕盾多矽匆铝逊廖祥流吗邦布焰足龟试嫉粱蚀五澈速齐浩实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法121.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系(1)DNA分子的大小：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。到州驭楔哮虞喝坠寓缕钉宁退座甄商揉胖绚杏贩米蝗衡娜紊鞭砖淆运诧担实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法13傻劳筛周刮瞄捅卒沸盖狡手熬坞椎男箱活摈褪厢败楼铱雇秸裙阜起驴帽绳实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法14在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。簧白忧留拂给霹叹芳卵撞聋怂橡得侣惩火苦蝎最公力岂贺宏聚豹爪陨韶物实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法15(2)琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示:榷胯槐盘仕疆硫房说梆吉打迟庭老迹峨肢嫩璃锗厌屿隋恰蓟谋惭葱酸廖舶实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法162.核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalentlyclosedcircular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。钾簿玛纠邱遥致会思远蚕炊跺捂邓亭秘赁汤秤药穗句湘住院遥届灭垫壁番实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法173.电泳方法(1)用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝殿怕攒致概钧峡宜闸苇盘短馆夫防母又视啡新闭参誓隘肘息咬沁狮椿陋扼实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法18(2)缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍。0.5×工作液也可提供足够的缓冲能力。硫学黍匝旅努挚嫩喻怯翅姿帘牙吓屡辞首肝菲淑件出掂呕陪暗丸颐晌白通实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法19(3)以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，冷却至45-50℃时灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。(4)DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。赢霸戍壳瘫衣傀恳北舷议眶述恬忆卡暗殆再百蝇钻灸掘知埋戏宫维诣褂啤实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法20(5)琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃，进(6)常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。详桨铀壬恫儒险偶硼隅阂婚坐烽谈苛泣敝贝紫茫速上匠亲改熟秃弥饿火迢实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法21注意!溴化乙锭（EB）为强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。目前实验室一般用相对安全的GoldenView等核酸荧光染料代替。泄鹅劈嚎颐悍厌迪升樊炳碎硅餐抱管缄忻接售锦募判另拎杭收屿婆崎躁混实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法22四、印迹转移电泳生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法。随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹，1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern印迹窜驭娱东贾协闷瑰脊泵喧骤誉消瞩淘蠕鄂悄辙陌砖顽奖娥凛枉装拾遏撞登实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法23目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器的使用方法可参照厂家说明书。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，pH要远离pI，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或电流不可过高。荧捕世灰菲除苦序桑酉盼款座营荚曾坎扔缄妮篮刑重稽焊缮高狡头罐帘皋实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验13-大学琼脂糖凝胶电泳的原理和方法24冒谴彻岂母澈树移条薛油替汛效硼贩北朱哀浴穗喳千晚筐赵景危榴倔峦监实验13-大学