荧光定量PCR技术原理与结果分析

荧光定量PCR技术原理与结果分析罗喜鹏一、含义二、优越性三、应用四、定量方法五、荧光材料六、结果分析一、含义实时荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。二、优越性特异性荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。敏感性荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。重复性荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。自动化无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。三、应用用于核酸的定量如RNA、DNA的定量用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。四、定量方法1.标准曲线法的绝对定量2.标准曲线法的相对定量3.比较CT法的相对定量五、荧光材料荧光探针和荧光染料◇SYBRgreenI◇水解探针TaqMan◇分子信标◇杂交探针SYBRgreenI未结合的SYBRgreenI水解探针TaqMan荧光素淬灭剂与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRADABCYL探针与目标序列配对时，发生荧光共振能量转移(FRET)光能量转移Taq游离的探针荧光基团淬灭剂延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光分子信标荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补淬灭剂茎(5-7bp)环（15-30bp）FAMTexasRed探针杂交到DNA模板光发出荧光DNA模板淬灭剂茎环光淬灭杂交探针5’5’5’发出荧光5’5’5’5’六、结果分析基线（Baseline）指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光域值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。基线期指数期线性期平台期荧光阈值线CT值融解曲线分析融解温度TM非特异扩增产物目的基因产物比较CT法的相对定量表达差异计算假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出目的基因的量=2-ΔΔCtΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数