水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测

水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（1）录入时间:2010-9-2511:17:29来源：生物信息网（一)实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。（二)实验原理水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。(三)实验器材(1)菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。(2)大肠菌群的测定；1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。②伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g，K2HP042g，2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。③乳糖发酵管：除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四）实验方法(1)水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。(2)细菌总数的测定：1)水样稀释及培养：①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。2)计算方法：作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。3)计数的报告：①平板菌落数的选择：选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。②稀释度的选择：a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字(l例2、例3)。c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。③细菌总数的报告：细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。(3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：表1稀释度的选择及细菌数报告方式稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.6×1042多不可计295461.63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313-313000310000或3.1×105527115-270270或6000-＜10＜107多不可计30512水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（2）录入时间:2010-9-2511:22:11来源：生物信息网1)生活饮用水或食品生产用水的检验：①初步发酵试验：在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37℃培养24h。②平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表2（或表3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。2)水源水的检验：用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。①严重污染水：1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。②中度污染水：10．1，0．1，0．01mL各1份。③轻度污染水：100，10，1，0．1mL各l份。④大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。表2大肠菌群检索表（饮用水）012备注每升水样中大肠菌群数0＜3411接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069＞230表3大肠菌群数变异不大的饮用水阳性管数0123接种水样总量300mL（3份100mL）每升水样中大肠菌群数＜3411＞18表4大肠菌群检索表（严重污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001----＜900接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL---+900--+-900-+--950各一份）--++1800-+-+1900-++-2200+---2300-+++2800+--+9200+-+-9400+-++18000++--23000++-+96000+++-238000++++＞238000表5大肠菌群检索表（中度污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1010.10.01----＜90接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01mL各一份）---+90--+-90-+--95--++180-+-+190-++-220+---230-+++280+--+920+-+-940+-++1800++--2300++-+9600+++-23800++++＞23800表6大肠菌群检索表（轻度污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1001010.1----＜9接种水样总量为111.1（100，10，1，0.1mL各一份）---+9--+-9-+--9.5--++18-+-+19-++-22+---23-+++28+--+92+-+-94+-++180++--230++-+960+++-2380++++＞2380表7大肠菌群变异不大的水源水阳性管数012345678910每升水样中大肠菌群数＜10112236516992120160230＞230备注接种水样总量100mL(10mL10份)操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表4、表5、表6或表7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。附：滤膜法滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。(1)准备工作：1)滤膜灭菌：将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。2)滤器灭菌：准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。3）培养：将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。(2)过滤水样：1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。(3)结果判定：1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。①紫红色，