抗生素类药物的分析

第十一章抗生素类药物的分析张蕾中药分析教研室第一节概述1、抗生素的定义抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。一、抗生素药物的特点2、抗生素的来源:＊生物合成(发酵)＊化学合成或者半合成3、抗生素的特点（1）化学纯度低：（2）稳定性差：活性组分易发生变化同系物多，异构体多，降解产物多抗生素质量的复杂性二、抗生素药物的质量分析（一）鉴别试验（二）抗生素类药物常规检查项目：用化学法、物理化学法以及生物学法来确认是哪种抗生素1、稳定性指标：结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等3、安全性指标：异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、无菌试验2、控制有机和无机杂质的指标：溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等。（三）效价测定：有效成分的含量测定理化方法生物学法1、生物学测定法：以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准。稀释法比浊法管碟琼脂扩散法国际通用法CHP③既适用较纯精制品,也适用于纯度较差产品④已知或新发现抗生素都能应用⑤同一类型的抗生素,不需分离,可一次测定它们的总效价。①原理恰好与临床要求一致，更能够确定抗生素效价。②灵敏度高，需要样品量较小优点：缺点：①操作步骤多，测定时间较长②误差较大2、物理化学测定法：根据抗生素化学结构利用其理化性质测定主药的含量。优点：①操作简单、省时、方法准确②具有较高的专属性①不一定代表生物效价缺点：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类三、分类（按结构与性质）：第二节β–内酰胺类抗生素青霉素类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)（一）结构和性质：头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACACONSOHNCOOHCH3CH3CH2（青霉素G、苄青霉素）NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)代表药物：NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林（氨苄青霉素）NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)代表药物：阿莫西林（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)代表药物：NONHSCH3COOHOCNH2CH27654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA头孢氨苄CH2NH2CONONHSCH3COOH7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA头孢拉定NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO头孢羟氨苄7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA头孢噻吩钠SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA酸性性质:与碱金属(Na+、K+)成盐1、羧基:7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACANSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)与有机碱(普鲁卡因)成盐C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACANSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)性质:2、手性C:﹡﹡﹡﹡﹡头孢菌素类:*C6*C7青霉素类：*C3*C5*C67654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACANSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)性质:﹡﹡﹡﹡﹡头孢菌素类：青霉素类：3、共轭体系母核无明显UV多数有苯环取代基母核有共轭体系7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-AminocephalospoanicAcid,7-ACANSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)不稳定四元环张力大酰胺键易水解性质:4、β–内酰胺环+-+2HOHOHA[O]T、、、酶、羟胺、、、降解-内酰胺类抗生素失效青霉胺＋青霉醛＋CO2（最终产物）强酸性完全水解ⅰ青霉二酸加热或增强酸度最终产物中强酸性（pH=2），室温不完全水解ⅱ青霉烯酸弱酸性（pH=4）不完全水解青霉二酸继续水解最终产物强性或△ⅲ青霉噻唑酸碱性or青霉素酶脱羧青霉噻唑酸△or酸性orHgCl催化最终产物弱酸性,△－CO2ⅳ（一）K+、Na+反应二、鉴别试验焰色→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓黄Na+焰色→紫色+0.1%四苯硼钠+Ac→↓白K+（二）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类青霉素＋盐酸羟胺醇制KOH（OH－）红色络合物羟肟酸衍生物中性溶液，铁离子（Fe3＋）红色络合物NSONSCOHNHOHH2NOHHClNSCHNHOFe3+3OH+Fe3+/3（红、棕、褐）2、硫酸及硫酸-甲醛反应硫酸-变色酸反应硫酸-硝酸反应（二）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类青霉素＋盐酸羟胺醇制KOH（OH－）红色络合物羟肟酸衍生物中性溶液，铁离子（Fe3＋）红色络合物3.茚三酮反应蓝紫色氨基茚三酮△α-氨基NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2蓝紫色α-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式茚三酮茚三酮缩合蓝紫色+H2OCNCH2RCOH2RCHH2NCOOH2OHCCOCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO4.双缩脲反应β-内酰胺类CONH紫内酰胺类碱性酒石酸铜（开环分解）似肽键2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH蓝紫色5.与变色酸-硫酸反应活泼“-CH2-”青霉素阿莫西林氨苄西林24HSOHCHO变色酸阿莫西林褐色150℃（缩合）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2242HSO-CH-HCHO变色酸羰基侧链含显色SO3HSO3HHOHOSO3HSO3HHOHOOHOHHO3SHO3SCHHCHO（缩合）6.与重氮苯磺酸反应65-CH-OH重氮苯磺酸橙黄色（偶合）酚羟基头孢哌酮（三）沉淀反应1.遇酸→↓白青霉素青霉素钠　青霉素钾　H在过量HCl或有机溶剂中溶解2.有机胺盐反应重氮化-偶合反应青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素H重氮化-偶合反应红芳伯氨基光谱法（四）1、UV法A,Emin,max,,%1cm1光谱图样品、分解产物nm339HA苯唑青霉烯酸苯唑青霉素Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50氯唑青霉素3410.682双氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328max%1cm1E(nm)ml/g502、IR法117401815cm~VOC116901710cm~VOCβ-内酰胺环酰胺色谱法（五）1、TLC法对照品对照法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fR2、HPLC法Rt比较供试品对照品相同条件三、含量测定IINaOH头孢菌素族青霉素族（水解）H（一）碘量法1.原理水解产物OSNaNaIOSNaI＋＋定量过量剩余β-内酰胺类ChPNSCH3CH3COOHOHNRCORCOHHNCOONaCH3CH3SNCOONaI24+5H2O+2HClNaOHCCH3CH3SO3HCHNH2COOHCHNHCORCOOH2+2NaCl++8HI第一步第二步理论上:1mol青霉素≈8molI原子;实际上:1mol青霉素≈8~9molI原子※温度，放置时间，pH，浓度，碘过量程度，杂质多少等影响因素。（1）主试验：2.方法1Mol/LNaOH1.0mL1moL/LHCl1.0mL20min放置供试品pH4.55.0mL20~25C22315min20min0.01mol/LNaSO缓冲液暗处放置（2）空白试验：pH4.55.0mL20~25C22315min20min0.01mol/LNaSO缓冲液暗处放置供试品I2液（定过量）I2液（定过量）例注射用普鲁卡因青霉素含量测定取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在20～25℃暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。V样空V样对照液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴V对空V对供试液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴空白试验A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差以未经水解的样品作空白测定采用标准品平行对照测定A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致3.条件（1）弱酸性：pH4.5（2）温度：24～26℃温度＞38℃未水解的供试品亦消耗碘（3）水解时间：以水解20分钟后的耗碘量最大。4.特点（1）灵敏度高样品:碘=1:8（2）反应条件、实验操作要求高V对、V对空V样、V样空1份含量加试剂次序、反应时间、滴定速度相同10~100μg/ml5、计算0s0V-VW1mIU100%V-VW供供对对（）标示量%（）标示量00V-VW1CsDIU100%V-VW供供对对（）标示量%（）标示量（二）汞量法1.原理SHROH青霉素族（水解）HgRS）（青霉素族ChPHg.pH2.方法样品以未经水解的样品作空白测定3HNONaOH水解32HgNOpH4.6V醋酸盐缓冲液供