纤维素酶离子液体兼容系统水解木质纤维素生物质

纤维素酶离子液体兼容系统水解木质纤维素生物质目录摘要介绍材料与方法结果讨论摘要•离子液体（ILS）已经被越来越多地作为一种新型的溶剂应用于溶解和预处理纤维素。但是即使低浓度的离子液体存在，纤维素酶也会失活。为了更充分地利用离子液体，开发一种能够有效溶解和激活木质纤维素生物质，并且能使纤维素酶保持高稳态和高活性的兼容的木质素离子系统显得尤为迫切。•本研究中，我们研究了商业上可获得的纤维素酶混合在不同浓度的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的稳定性和活性。介绍•从木质纤维素原料生产的生物燃料和化学品是一种重要的替代传统石油衍生品的选择。然而，木质纤维素生物质由于其结构的复杂性，酶很难将其有效水解。于是需要经过必要的预处理。但是目前所有的预处理方法往往没有选择性，而且产生副产品抑制下游的单糖发酵转化成乙醇和其他产品。介绍•最近，一些研究表明，离子液体可以有效地溶解的木质纤维素生物质，如柳枝稷，白杨树和松树木材，小麦秸秆和玉米棒子离子液体•离子液体是指全部由离子组成的液体•与典型的有机溶剂不一样，在离子液体里没有电中性的分子，100%是阴离子和阳离子，在负100℃至200℃之间均呈液体状态，具有良好的热稳定性和导电性环境友好无有害气体价格相对便宜易与产物分离对水具有稳定性可反复多次循环使用优点易回收介绍•本研究考察了•1、在1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐存在下市售纤维素酶和葡萄糖苷酶的混合物的稳定性和活性。（1-乙基-3-甲基咪唑乙酸由于具有低粘度，低熔融温度，且能在相对温和的条件下降解纤维素和整个生物体，从而被选为本次实验的离子液体。）•2、在15%1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐缓冲溶液共溶混合物中微晶纤维素（一种典型地纤维素）的转化率。材料与方法2离子液体中北美鹅掌楸(YP)的水解4材料31微晶纤维素在离子液体中的水解331-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐离子液体中纤维素酶的稳定性研究材料•离子液体(1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐)，柠檬酸一水合物，3,5-二硝基水杨酸（DNS），氢氧化钠，酒石酸钠钾，苯酚，偏亚硫酸氢钠，羧甲基纤维素（CMC），和微晶纤维素PH-101（微晶纤维素含有超过97％的纤维素和小于0.16％的水溶性材料）均购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，MO）。•离子液体用干燥剂干燥和在真空下存储防止水的吸收材料•纤维素酶（Celluclast1.5L，里氏木霉产生的真菌纤维素酶）•β-葡萄糖苷酶（Novozyme188，来自黑曲霉）•纤维素酶混合物：纤维素酶(Celluclast1.5L)和纤维二糖酶(Novozyme188)•北美鹅掌楸：粉碎后，进行一个提取处理（用乙醇除去非结构性抽提物）注：纤维素酶的活力以每毫升原酶溶液的滤纸单位（FPU）来计算在1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐离子液体中纤维素酶的稳定性研究•将体积为2mL的酶混合液与不同浓度的离子液体（0%（对照），5%，10%，15%，20%，30%体积分数）在柠檬酸盐缓冲剂（50mM，pH4.8）中进行反应稳定性实验•取出等分在不同的反应时间（1.5，3，24小时）试样，测定残留的酶活性。•通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定羧甲基纤维素产生的还原糖来确定纤维素酶的活性l标准D-葡萄糖溶液（0.25-2毫克/毫升）与不同浓度的离子液体（5-20%，0%作为对照）进行混合，进行DNS检测。确定纤维素酶活性的测定方法如下：将2体积DNS试剂混合于柠檬酸盐缓冲液50mM（pH4.8）里，2%纤维素（w/v）与纤维素酶反应一小时微晶纤维素在离子液体中的水解1、微晶纤维素在离子液体中的预处理2、微晶纤维素酶法糖化在烧杯中将240mg微晶纤维素溶于15mL离子液体中制成1.6%（w/v）的微晶纤维素溶液，50℃中处理24h。预处理后，将溶液用85mL柠檬酸缓冲液稀释。酶加入后在50℃180rpm反应。0,1,3,6,9,12,24h时用DNS检测还原糖浓度，为更准确，还用HPLC检测。未经处理的微晶纤维素平行对照。微晶纤维素在离子液体中的水解3、木质素对微晶纤维素水解的影响将30,90和150mg木质素混合于15mL含有240mg微晶纤维素的离子液体中，也就是0.2%,0.6%,1.0%的木质素和1.6%的微晶纤维素。72℃，其余预处理步骤一样，用酶水解68h。检测方法同上。离子液体中北美鹅掌楸(YP)的水解15mL离子液体中加入600mg北美鹅掌楸，制成4%(w/v)的北美鹅掌楸的溶液。该溶液60℃中搅拌72h。上述溶液用85mL柠檬酸缓冲液稀释，加入纤维素酶，50℃，180rpm摇瓶培养。用DNS法和HPLC法如之前步骤检测0℃，室温（25℃），60℃，100℃下。与YP的酶法糖化检测方法相同。YP的预处理YP的酶法糖化YP水解时，缓冲液温度的影响结果1、离子液体中纤维素酶的稳定性研究5%,10%,15%,20%和30%离子液体，分别在4℃和50℃下1.5h，3h，24h平行反应。结果如下：4℃1、1.5h，对应的酶活保留96%,90%,87%,82%,75%即使在30%浓度下，反应2、24h，依然保持70%的活力50℃在50℃中反应24h，离子液体浓度为5%、10%的酶活依然有86%、76%。当浓度上升到20%时，酶活下降到63%。到浓度为30%时，就只有初始酶活的33%了2、微晶纤维素的酶法糖化1、50℃离子液体中处理过24h的微晶纤维素和未处理过的微晶体纤维素，分别加入纤维素酶，定时测定还原糖含量，如下：1、在15%离子液体中，在开始3小时就水解了76%纤维素。2、24h后，处理过的微晶纤维素反应了91%，未处理过的只有49%2、微晶纤维素的酶法糖化2、不同浓度的木质素（(0.2%,0.6%和1.0%)和1.6%微晶纤维素共1L，分别加入纤维素酶，定时测定还原糖含量，如B：24小时后测总还原糖如图4：木质素对纤维素的酶法水解没有影响24小时后，测还原糖总含量1、同样显示：木质素对纤维素的酶法水解没有影响水解2、24小时后，91％的微晶纤维素（对照组，）被转化为葡萄糖，微晶纤维素含有木质素显示类似的高转化率分别为88％，88％和87％，2、北美鹅掌楸的酶法糖化1、离子液体处理过和未处理过的YP的比较，以及不同温度下，在各个时间点，产生还原糖含量如下：与未处理YP糖化结果相比，用离子液体活化过的YP明显改善。在前4小时，在处理过的YP中大概33%的纤维素被转化成糖，而未处理的只有3%2、北美鹅掌楸的酶法糖化1、离子液体处理过和未处理过的YP的比较，以及不同温度下，24h产生还原糖总含量，如下：1、室温下，在24h反应后，离子液体处理过的YP转化率达到45.3%而无处理的只11.3%。2、浓度分别为54%，45.3%，44.8%，48.8%讨论•生物质的预处理是高效的纤维素转化的关键过程，一直被认为是从纤维素生物质产生的生物乙醇中最昂贵的处理步骤。我们的研究初步表明1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐离子液体能够在温和的条件下水解纤维素。（未报道过）•同时也研究了北美鹅掌楸在该离子液体预处理后，能够明显提高转化率，表明该方法有效。（未报道过）