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Taqman法荧光PCR引物探针设计与目标序列互补实时荧光定量PCRTaqMan法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，20－30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为58-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同总体原则•查阅参考文献，以选取待检病原体的靶基因。•目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对，确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列•先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。•所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。•扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。•保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。•为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）•将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。探针设计原则•探针位置尽可能地靠近上游引物•探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性•检测探针的DNA折叠和二级结构•Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%•探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5‘G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。•整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。•为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。引物设计原则•序列选取应在基因的保守区段•避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构•典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。•Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%•引物之间的TM相差避免超过2℃•引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基•为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。•Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp•引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性-----阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点TMA检测技术示意图TMA扩增反应原理图技术原理•同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。分子信标探针结构自由能控制在3~5之间Non-T7引物CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTTT7引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAacctatcctatttgtacatccattcaTMA检测技术的优势→领先的RNA检测技术TMA技术检测病原体RNA。一个病原体细胞内含有多达个RNA拷贝，大大提高了检测灵敏度。→先进的恒温扩增技术核酸扩增在一个温度下进行（42℃），不需要热循环。→更高的检测灵敏度和准确性TMA技术的扩增效率极高，15～30分钟即可将模板扩增倍，检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术。→有效的解决了核酸检测的污染问题污染是核酸检测的最大问题。TMA技术的扩增产物为RNA，环境中自然降解，污染少，更进一步提高检测结果的可靠性。→高效率的自动化检测TMA技术采用实时荧光检测，仪器自动化程度较高，解放了操作人员，并且能够得到标准、稳定的结果。TMAVSREAL-TIMEPCR都采用实时荧光检测技术TMA与PCR检测相比较灵敏度更高；特别是加入内标后，PCR检测灵敏度下降很大TMA检测产生的放大终产物是RNA，而PCR产生的是DNA；RNA很容易自然降解，而DNA则较为稳定，即TMA检测在污染控制方面更为容易TMA操作不需要复杂的热循环仪，普通水溶即可；而PCR检测需要热循环仪TMA放大效率高达1000拷贝/循环，而PCR仅为2拷贝/循环免疫学诊断（抗原抗体检测，Elisa）PCRRT-PCR（RealTimePCR）转录介导的核酸恒温扩增技术（TMA，NASBA，TMA）直接培养全球诊断技术发展的四个阶段灵敏度低导致漏检误检等缺陷检测周期过长由于成本低，在发展中国家仍广泛使用灵敏度落后于最新的核酸恒温扩增技术过渡性技术，在血筛领域正逐步被第四代技术取代最新诊断技术，具有高灵敏度、高特异性优势，极大降低漏检误检率相对成本较高，但在血筛等市场已成为主流技术由于成本低，在发展中国家仍广泛使用“窗口期”问题是该技术用于血筛领域的致命缺陷