高致病性禽流感血凝(HA)

高致病性禽流感血凝（HA)和血凝抑制试验（HI）庆城县疫病预防控制中心简介•禽流感（AD）是有正黏病毒科A型禽流感病毒中有致病性的任何一型毒株引起以禽类为主的烈性传染病。我国将其列为一类动物疫病。•流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，可以识别并吸附于红细胞表面受体的结构，出现血凝现象。但是当病毒悬液中加入特异性抗体，且该抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素与红细胞表面受体相结合，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞凝集现象就被抑制，称为血凝凝集抑制(HI)反应。简介•血凝实验（HA）-血凝抑制（HI）实验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的实验方法。•可用于鉴定所有的流感病毒分离株•可用来检测家禽血清中的感染或免疫抗体•本实验室常采用HA-HI实验检测禽血清中的免疫抗体实验的原理、用途•用已知抗原测抗体：抗体可以抑制抗原凝集红细胞。•用来检测禽流感疫苗免疫水平实验准备工作试验用溶液的配制1、鸡红细胞保存液（阿氏Alsevers液)配制阿氏液（Alsever'sSolution）是一种红细胞保存液，含有抗凝剂柠檬酸钠和细胞需要的养分葡萄糖。葡萄糖---2.05克柠檬酸钠--0.8克柠檬酸--0.055克氯化钠---0.42克加蒸馏水至100毫升，加热溶解后将pH值调到6.1，经过69千帕，15分钟的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。阿氏液主要用于保存红细胞，在4℃的环境下，红细胞可以保存2周而不改变活性和特性。因此阿氏液用于采血、保存和运送红细胞进行化验。2、1%鸡红细胞悬液制备采血用注射器吸取阿氏液1ml，取至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液3-4ml，与等量的阿氏液混匀，装入离心管中备用。洗涤红细胞将离心管中的血液经过1500-1800r\min离心8分钟，弃去上清液，在沉淀物中加入本实验要求的PBS液，轻轻混匀，以均匀沉淀的红细胞，在经过1500-1800r\min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀的红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，4℃保存备用。1%鸡红细胞悬液制备用微量移液器取洗涤后的红细胞沉淀泥0.1ml，加入到9.9ml本实验要求的PBS液，轻轻混匀，制成1%鸡红细胞悬液，备用。3、pH7.2、0.01mol/LPBS的配制a)配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）和0.79g磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）加蒸馏水至100mL。b)配制1×PBS：量取40ml25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL。c)用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。d)灭菌或过滤。e)PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。PBS对其它酸碱物质具有一定的缓冲能力，维持反应所需的pH，因而比使用生理盐水的效果好。仪器及诊断液等的准备96孔V型微量血凝集反应板、微量吸液器、混合振荡器、恒温培养箱、待检血清、鸡新城疫标准阳性血清和阴性血清、pH7.2、0.01mol/LPBS、1％鸡红细胞悬液。稀释禽流感病毒H5亚型抗原：用注射器吸取本抗原规定剂量加入PBS液稀释好备用。稀释禽流感H5亚型标准阳性血清：用注射器吸取本血清规定剂量加入PBS液稀释好备用。待检血清要新鲜、无杂质、无红细胞、不腐败，盛血清的容器要清洁。注意：所有试剂及待检血清在试验前必须恢复室温，且室内温度保持在（20-25℃）血凝（HA）试验•抗原效价的测定1.在微量反应板的1孔~12孔均加入25ulPBS液，换滴头。2.吸取稀释禽流感病毒H5亚型试验抗原25ul加入第1孔，吹吸取10~15次混匀。3.从第1孔吸取25ul病毒抗原液加入到第2孔，吹吸同样次数混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25ul弃之，换滴头。4.每孔再加入25ulPBS。5.每孔均加入25ul1%RBC液。6.振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察结果。7.结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位。血凝试验（抗原效价的测定）操作表孔号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照PBS液252525252525252525252525病毒液25252525252525252525251%红细胞252525252525252525252525微型振荡器1min，静置30min弃50结果观察++++++++++++++++++++++++++++++++++--抗原效价的测定结果判定1、红细胞100%凝集的抗原最高稀释度为血凝价。2、“++++”为100%凝集，“++”为不完全凝集，“—”为不凝集3、上表例抗原血凝为2564、对照孔的红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底抗原回归试验1、4×单位抗原配制血凝价数除以4，如表一256÷4=64，即1毫升（抗原）+63毫升（PBS）即成。2、4×单位抗原验证配制好后和每天应用前都必须对4×单位抗原进行测试验证，操作按表二进行。3、作两排孔第1-5孔加PBS液25ul4、第1孔加4×单位抗原液25ul，吹吸10-15次混匀吸取第2孔用同样次数吹吸混匀吸取25ul加入到第3孔，如此进行到第5孔弃去25ul，换滴头。5、每孔再加入25ulPBS。6、每孔均加入25ul1%RBC液。7、振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察结果。血凝试验（抗原效价的测定）操作表孔号123456789101112病毒稀释度2*1*0.50.251:32做两排PBS液25252525254×单位抗原2525252525弃501%红细胞2525252525微型振荡器1min，静置30min结果观察+++++++++++-1×单位抗原孔的红血球必须达到100%凝集，同时0.5×孔红血球达到50%凝集，50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配。4×单位抗原验证结果判定血凝抑制试验•加PBS液在微量反应板上的1孔~11孔加入25ulPBS，第12孔加入50ulPBS。•加被检血清吸取25ul被检血清加入第1孔吹吸吹吸取10~15次混匀。从第1孔吸取25ul血清稀释液加入到第2孔，吹吸同样次数混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25ul弃之，换滴头。•1~11孔均加入含4×单位抗原液25ul，室温下静置30min。•每孔均加入25ul1%RBC液。•振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察结果，对照孔红细胞将呈纽扣状沉于孔底。•结果判定；以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI的滴度。血凝抑制试验操作表孔号123456789101112血清稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照PBS液待检血清2525252525252525252525252525252525252525504×单位抗原2525252525252525252525弃501%红细胞252525252525252525252525微型振荡器1min，静置30min结果观察-------++++++++++++++-血凝抑制试验结果判定•100%抑制红血球凝集的血清最大稀释度为血凝抑制价•表（三）的血凝抑制价为128×。•判定标准：AI血凝抑制价小于或等于8×（3㏒2）判为阴性；等于16×（4㏒2）为可疑，需复检；大于或等于32×（5㏒2）为阳性。