CCK8实验

CCK8实验具体操作步骤：1.将昨日铺的96孔板拿出，在操作台上用直吸管将铺有细胞的60个孔里面的上清液全部吸掉，再加PBS200ul洗一次，最后将96孔板里面所有的液体全部吸掉。2.96孔板加药：先加药-----再加无血清培养基-----最后再加PBS1PBS2PBS3PBS4PBS5PBS6PBS7PBS8PBS9PBS10PBS11PBS12PBS2PBS加无血清培养基200ul0.5μg／mL组：加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基1μg／mL组：加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基：2μg／mL组：加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基3μg／mL组：加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基4μg／mL组：加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基5μg／mL组：加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基加无血清培养基200ul2PBS3PBS同上同上同上同上同上同上3PBS4PBS同上同上同上同上同上同上4PBS5PBS同上同上同上同上同上同上5PBS6PBS同上同上同上同上同上同上6PBS7PBS同上同上同上同上同上同上7PBS8PBS2PBS3PBS4PBS5PBS6PBS7PBS8PBS9PBS10PBS11PBS12PBS3.全部加完后，放于混匀振荡器上振荡3分钟。4.最后放入培养箱中继续过夜培养。兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养文章来源：2006-7-1914:41:08兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养第二军医大学学报2000年第21卷第3期徐青镭吴海山周维江摘要目的：评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程重建中种子细胞的可能性。方法：采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养，并研究其增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。结论：兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻，用作半月板组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。关键词：间充质干细胞；骨髓；半月板骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有多量的间充质干细胞（MSC）。如同多能造血干细胞的存在赋予骨髓组织以强大的造血功能以维系血液系统的新陈代谢一样，这些MSC的存在为骨软骨组织的损伤提供了潜在的修复能力。但是与造血干细胞相比，骨髓中MSC的含量并不丰富。本实验拟通过体外细胞培养的方法将MSC自骨髓血中分离出来并加以纯化，并进一步在体外培养条件下研究其增殖及生长特性，从而探讨为半月板的组织工程重建提供种子细胞的可能性。1材料和方法1.1兔骨髓MSC的分离取成年新西兰兔10只，6个月龄，雌雄不拘，平均体质量3.2kg(2.8～3.7kg）；用3%戊巴比妥钠按1mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5ml注射器，内含3000U/ml的肝素0.1ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心180×g，5min；弃去上清液，沉淀用Hamf12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保留10min，取出再离心180×g，5min；弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细胞量达106～107后，即可进行原代培养接种用。1.2兔骨髓MSC的原代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于6孔培养板内，加入Hamf-12培养液，于37℃，10%CO2条件下培养；于接种5d后进行第1次换液，以后隔日换液。每天随机抽取3只实验动物的MSC作细胞生长动力学分析，各取此三者的1个培养孔用0.25%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5min），并作贴壁细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。将此3个实验动物MSC每天的细胞计数取平均值，作原代细胞培养的生长曲线分析。1.3兔骨髓MSC的传代培养原代培养一旦铺满整个培养孔的表面，即可用0.25%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5min），然后按1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面。再重复以上操作，用0.25%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5min），并按1∶3的比例进行下一代传代接种培养，并记为P2，余类推。将随机抽取作原代培养细胞生长动力学分析的3个实验动物MSC的P1代分为两组，一组连同其余样本的第1代一并留作后续实验用，另一组则用作传代培养的细胞动力学分析。传代培养的接种密度严格地控制于与原代培养接种密度相同的水平以便于对照。每天各取1个实验动物MSC的1个培养孔用0.25%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5min），并作贴壁细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底面。将此3只实验动物MSC每天的细胞计数取均值，作传代细胞培养的生长曲线分析。1.4兔骨髓MSC的自我更新能力分析将随机抽取作原代、传代培养细胞生长动力学分析的3只实验动物MSC由P1代开始，逐代进行传代培养，直至培养细胞出现衰老征象，停止传代培养。以细胞群体倍增值（populationdoublings,PDs）作为分析兔骨髓MSC的自我更新能力的指标，每代细胞培养的PDs值按以下公式计算［5］：PDs=lg（培养后细胞计数/培养前细胞计数）/lg2将各代PDs值累加即得最终的累积细胞群体倍增值（cumulativepopulationdoublings,CPDs）。1.5数据分析采用SPLM软件（线性拟合统计软件，第四军医大学统计学教研室）将以上3个样本的实验测定值取均数，作完全随机资料的方差分析，均数的两两比较采用SNK法。2结果2.1兔骨髓MSC原代培养的生长曲线分析兔骨髓MSC原代培养生长曲线（图1）显示，原代接种后的5～7d为MSC生长的潜伏期，此期主要为MSC的贴壁生长阶段，培养细胞的有丝分裂活动不甚活跃；第8天开始，相差显微镜下可以观察到贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，说明此时细胞的有丝分裂活动开始变得活跃起来；第8～10天这些细胞克隆进一步扩大，许多细胞克隆彼此相连，细胞生长曲线显示此阶段细胞数目呈指数级递增，此期为MSC原代培养生长的对数增殖期；第11～13天，细胞克隆彼此相连并铺满整个培养孔底面的大部分，细胞生长曲线显示MSC生长进入一个平台期；第14天，贴壁生长的MSC开始铺满整个培养孔底面，原代培养结束。2.2兔骨髓MSC传代培养的生长曲线分析传代培养多数样本于P10代以后开始出现衰老征象。传代细胞的生长较原代要快些，多于接种后9d即可铺满整个培养孔的底面。我们选择P1，P5，P10三代传代培养的生长曲线（图1）进行观察比较，发现早、中、晚三代传代培养具有以下共性特征：传代培养潜伏期约为24～36h；传代培养对数增殖期约为4～6d；对数增殖期结束后至接种后第9天，MSC生长逐渐缓慢，进入平台期。图1兔骨髓MSC的P1，P5及P10传代培养生长曲线fig1ThegrowthcurveofP1,P5andP10passagedcultureofrabbitbonemarrow-derivedMSC○:P1;□:P5;△:P102.3兔骨髓MSC自我更新能力分析随着传代培养代数的渐次增加，兔骨髓MSC的生长速度有逐渐缓慢的趋势。传代接种第5天后，P5、P10的MSC生长速度渐次减缓，至接种后第9天计算所得的MSC数目P10＜P5＜P1。统计学处理结果表明，此3组细胞的数目之间由第4天开始相差非常显著（表1）。传代培养观察发现，所随机抽取的3个样本分别于P12、P12、P14出现衰老征象，故统计MSC的PDs及CPDs计算至P12。由图2可见，从P1至P10平均每代MSC的PDs值约为2，而P10之后的P11、P12则仅为不足1；CPDs值为35.4±2.1，其中10.1的群体倍增发生于原代培养阶段，占平均CPDs值的28.5%，说明在原代培养及P1至P10阶段的体外培养分离中，mSC的有丝分裂活动旺盛，具有活跃的增殖倍增能力。表1兔骨髓MSC的P1，P5，P10传代培养的细胞增殖数目比较tab1ComparisonofthenumberofP1,P5andP10passagedcultureofrabbitbonemarrow-derivedMSCDayCellnumberofP1CellnumberofP5CellnumberofP10FvaluePvalue+s(n=3)+s(n=3)+s(n=3)112.7±1.513.0±2.014.3±1.50.80770.4891217.0±2.016.3±2.118.0±2.00.51350.6225328.7±4.029.0±3.022.3±2.14.28090.0700464.7±7.144.3±4.730.3±3.132.71140.0006578.3±4.061.0±3.638.7±4.276.26430.00016103.7±5.572.7±5.545.3±4.792.36550.00007118.0±3.680.7±3.550.7±4.0245.79200.00008124.3±6.194.0±4.654.0±3.6157.01400.00009136.3±7.4107.7±4.557.0±3.0173.59360.0000图2兔骨髓MSC的原代及各传代培养的pDs与CPDs变化fig2Thechangesofprimaryandpassagedcultureofrabbitsbonemarrow-derivedMSC3讨论干细胞是指那些具有自我复制能力，并且可以经过不可逆的终末分化过程产生子代细胞的细胞，它可以通过各种子代细胞、前体细胞的分化谱系产生多种细胞表现型的表达。成年人骨髓中存在一定数目的MSC，能够通过分化形成多种中胚层组织，包括骨和软骨组织、肌腱、肌肉、脂肪组织以及骨髓基质结缔组织［1］。1991年，Caplan［2］总结多年的研究成果及其他研究组的结论，提出如同骨髓中存在造血干细胞以维持整个造血系统的新陈代谢一样，肌肉骨骼系统中也必然存在MSC以维持其代谢及创伤修复，而骨髓即是机体储存MSC的少数几种组织之一。在此基础上，Bruder等［3］于1994年提出利用自体MSC修复肌肉骨骼系统的的组织缺损。目前，这一设想正越来越多地受到人们的关注与重视。细胞生物学原理显示细胞的数量及密度对其增生和分化特性会产生很大的影响［4］，而相对于骨髓中其他种类的细胞而言，MSC在骨髓中的丰度并不高，因此将体内的骨髓MSC在离体条件下进行分离纯化并实行体外扩增就显得尤为重要［3］。我们的实验设计先通过离心去除抗凝骨髓血的血浆而保留其细胞成分，再经饱和NH4Cl溶液处理破坏红细胞，以体外贴壁培养去除悬浮生长的白细胞，所余的贴壁细胞即主要为MSC。兔骨髓MSC的原代培养生长曲线显示，MSC在体外培养条件下的生长与其他细胞一样经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期。原代培养的PDs值为10.1，这一方面证实MSC在骨髓中的丰度较低，另一方面则说明MSC的增生分裂能力十分活跃。因此通过离体培养，使体内环境下低丰度的骨髓MSC实现数目扩增的设想是可行的。传代培养的结果显示，在经历了10代的传代培养以后兔骨髓MSC才出现衰老征象，即细胞增生速度缓慢，多数细胞出现核固缩、核碎裂及由培养孔底面脱落等，这与许多其他种类细胞的体外传代培养的结局相似。有关这种衰老现象出现的机理众说不一，其确切机制尚有待于进一步阐明。此外，与原代培养生长曲线相比，传代细胞的生长潜伏期较短，因此每代只需大约9d即可铺满培养孔底面。所有原代及传代培养的结果表明，体外培养条件下的MSC具有许多成纤维细