植物原生质体培养及细胞融合

第15章植物原生质体培养及细胞融合•植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术.•原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。•1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。1972年美国科学家Carl—son等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。•1974年高国楠等开发出了PEG融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合，获得了体细胞杂种——马铃薯番茄。1981年Zinune~ann开发出了高压脉冲法，即电融合技术.•植物原生质体培养和细胞融合技术成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理尝及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。(一)植物细胞膜电特性和膜电位•植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下，其细胞膜的膜电位也不同。(二)植物细胞壁的结构及其化学组成•植物细胞壁可分为初生壁(primarywall)和次生壁(secondarywall)，相邻两个细胞的初生•壁之间存在中层(middlelayer，亦称胞间层)。初生壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶，还有少量结构蛋白。纤维素是p—1，4连接的D—葡聚糖，含有不同数量的葡萄糖单位。纤维素化学性质高度稳定，能够耐受酸碱及其他许多溶剂，是一种比较亲水的晶质化合物。半纤维素是存在于纤维素分子之间的一类基质多糖，它的种类很多，如木葡聚糖和胼胝质等。细胞壁内的蛋白质主要包括伸展蛋白、酶和凝集素等。次生壁主要由纤维素和半纤维素组成，次生壁分为外层(S1)、中间层(S2)和内层(S3)，次生壁上外层、中间层和内层的分层主要是三层中的微纤丝排列方向不同的结果，中层主要由果胶酸钙和果胶酸镁的化合物组成。果胶化合物是一种可塑性大且高度亲水的胶体，它可使相邻细胞粘在一起，并有缓冲作用。果胶很容易被酸或酶等溶解，从而导致细胞分离。•细胞壁上常有附属结构。植物的某些细胞在特定的生长发育阶段可形成特殊的细胞壁，如花粉壁是由孢粉素的覆盖层和基粒棒层构成花粉外壁外层和外壁内层工，由纤维素构成外壁内层Ⅱ及内壁。•植物细胞壁的复杂程度因植物器官种类、成熟度和生理状态而异。选择原生质体分离的外植体材料时，一般选择较幼嫩的组织，最好选用试管苗、愈伤组织或悬浮培养细胞，这类材料的原生质体产率高，活性强，培养后细胞植板率高。(三)降解细胞壁的酶类及细胞壁降解机理•用于植物原生质体分离的酶类有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。•纤维素酶的商品酶主要有CellulaseOnozukaRS、GellulaseOnozukaR—10、GA3—867。其绍分为CX(P—1，4—葡聚糖酶)、C1(含p—1，4—葡聚糖纤维二糖水解酶)和p—葡萄糖苷酶等oCX能使纤维素分子链分离，破坏微纤丝的晶态结构。C1和p—葡萄糖苷酶则催化纤维素分子链水解为葡萄糖。•这两类酶均为内切酶，可随机切断主链内的糖苷键而生成寡糖，常用浓度为0.1％～0.5％。•果胶酶主要的商品酶有MaceozymeR—10、PectolyaseY23、Pectinase。其组分为解聚酶(又称多聚半乳糖醛酸酶)和果胶酯酶(又称果胶甲酯酶)，二者均能催化果胶质水解。解聚酶能催化以α—1，4—键连接的半乳糖醛酸水解为D—半乳糖醛酸及其二聚物、三聚物等。果胶酯酶能催化果胶质的甲酯水解成甲醇及其二聚酸。果胶酶的一般酶制剂含有一些有害的水解酶类，如核糖核酸酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、磷脂酶、酚和盐等。使用前应进行离心，，并尽量缩短酶解处理时间。•上述商品酶中，PectolyaseY23活性最强，其活性是MaceozymeR-10的近100倍，但处理时间不宜过长，一般不应超过8h。上述酶的常用浓度，MaceozymeR—10为0.2％～2.0％，PectolyaseY23为0.5％一022％，Pectinase为0.2％～2.0％。Pectinase杂质较多，其酶液在过滤灭菌前必须离心去除沉淀，否则很难进行过滤灭菌。(四)材料来源•1．材料来源供体材料是影响原生质体培养成功与否的关键因素之一。•原则上讲，植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料，目前较多采用叶片来分离原生质体，但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织或悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。2．预处理•常采用两种预处理方法：•①低温处理。以叶片等外植体为试材时，一般放在412下，黑暗中处理1～2d，其原生质体的产量高，均匀一致，分裂频率高。•②等渗溶液处理。把材料放在等渗溶液中数小时，再放到酶液中分离原生质体，能提高其产量和活性，尤其是多酚化合物含量高的植物，如苹果、梨等，采用这种处理方法效果好。(五)分离方法•1．机械分离法•但由于该方法获得的原生质体产量低，不能满足实验需要，而且液泡化程度低的细胞不能采用该方法，因此，机械分离法没有得到广泛应用。•2．酶分离法•1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生质体分离最有效的方法。•酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。•一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便，目前几乎均采用该方法。一步法实验操作步骤如下：•①取材。最好利用再分化能力强的愈伤组织或悬浮培养细胞或无菌苗的组织器乱。如果利用自然环境下栽培的植株叶片，应选取生长健壮植株上的充分展开的较幼嫩叶片，经洗涤剂洗涤和流水冲洗后，进行常规消毒和预处理后待用。•②酶液配制。根据实验材料确定合理的酶液组合，应注意酶制剂的种类、配比以及酶液的pH。•称取纤维素酶、果胶酶以及渗透压稳定萧等配成酶液，将酶液离心(2500～3000r／min)后，用0.45um微孔滤膜过滤灭菌，分装后-200C冷冻保存。为了提高原生质体膜的稳定性，一般在酶液中添加CaCl2·2H20和葡聚糖硫酸钾。•③酶解处理•将植物材料放人酶液中(每10mi酶液0.5～1.0g组织)，真空泵抽引渗透处理5min，以促进酶液渗透，然后置于往复振荡式摇床上(30～40r／min)，260C酶解处理2～8h.如果是幼嫩叶片，应尽量撕去下表皮或除去茸毛，切成1～2mm的细条。酶解处理期间可用解剖针轻轻破碎叶片组织，有利于原生质体的游离释放，提高其产量。•原生质体分离所用渗透压因植物器官种类而异，一般在0.3—0.5mol／L之间。渗透压调节剂一般采用甘露醇(mannitol)，如葡萄叶原生质体分离所用酶液组合。（表7-3）二、原生质体纯化•供体经过酶处理后，得到的是未消化组织、破碎细胞以及原生质体组成的混合群体，必须进行纯化。•植物原生质体纯化方法有三种：沉降法、漂浮法和不连续梯度离心法。（一）沉降法•也称过滤离心，该方法利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。首先用适当孔径(30～40um)的微孔滤膜过滤酶混合液，除去未消化的组织细胞等，低速(150g以下)离心3—5min，使原生质体沉淀，弃去含细胞碎片的上清液和酶液。然后用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤原生质体，重复2～3次。最后将原生质体悬浮在1～2ml的液体培养基中备用。•该方法的优点是纯化收集方便，原生质体丢失少，缺点是原生质体纯度不高。该方法是目前最为广泛.(二)漂浮法•其原理是根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同，分离出原生质体。原生质体的比重较小，在较高浓度的溶液中离心后会漂浮在液面上。在无菌条件下，把5～6ml浓度较高的溶液(如20％的蔗糖溶液)加入10ml的离心管中，其上轻轻滴人1～2ml酶一原生质体混合液，用锡箔纸封口，在150g下离心5min，使破碎的细胞或组织残片沉于底部，而原生质体浮于离心管上部的液面上。用吸管收集原生质体液层，用液体培养基或含有CaCl2·2H20的甘露醇溶液洗涤2～3次。最后将纯化的原生质体悬浮于1～2ml的液体培养基中备用。该方法的优点是获得的原生质体纯度高，缺点是原生质体的收率低。(三)不连续梯度离心法•在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g下离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的优点是获得的原生质体大小均匀致，纯度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收率低。三、原生质体活力测定•原生质体活力测定的方法主要有以下几种。•(一)荧光素二乙酸法(FDA法)•FDA染色后，无活力的原生质体不能产生荧光。在荧光显微镜下，能够分辨出有活力的原生质体，并计算出存活百分率。FDA法方便可靠，是目前最常用的方法。1．FDA母液配制•FDA不溶于水，能溶于丙酮。把2mgFDA溶于lml丙酮中作为母液，4℃冷藏贮存，贮期不宜过长。使用时取0.1ml母液加在新配制的10m10.5—0.7mol／L甘露醇溶液中，最终浓度为0.02％。2．染色观察•取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～10min。用荧光显微镜观察，激发光波长330～500nm，活的原生质体产生黄绿色荧光。用计数器计算存活百分率。(二)酚藏花红染色法•酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其最大激发和射波长分别为527nm和588nm。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈红色，无活性的原生质体因无吸收能力而五色。1．母液配制•称取适量的酚藏花红溶于0.5～0.7mol／L甘露醇溶液内，配成0.01％的母•2．染色观察•取一滴新鲜母液与原生质体悬浮液等量混匀，室温下染色5～10min，荧光显微镜下镜检。(三)形态观察法•一般凭形态特征即可识别原生质体的活力。如果颜色鲜艳，形态完整，富含细胞质，则有活力。也可采用渗透压变化法，把原生质体放人高渗或低渗溶液中，观察涨缩情况来判断其活力。如果体积能随溶液渗透压的变化而改变，即为活的原生质体。四、影响原生质体数量和活力的因素•(一)供试材料•供试材料是影响原生质体分离效率的主要因素之一。供试材料一般选用愈伤组织、悬浮细胞系或植株上的外植体。如果选用愈伤组织或悬浮细胞系，要注意选择继代后处于旺盛分裂时期的材料。愈伤组织则同时要注意挑选淡黄色、颗粒状的材料。如果选用植株上的外植体，一定要注意植株的年龄、生长发育状态、外植体组织器官的成熟度等。应选择生长健壮植株上较幼嫩的组织，该类材料的原生质体产量高，活力强，培养后植板率高。最好事先培养无菌试管苗，可免去材料消毒程序，避免消毒液对材料的伤害，大大提高原生质体的活力。(二)酶的种类、组合和酶解时间•酶制剂的纯度、浓度、活性以及酶解处理时间显著影口向原生质体的产量和活力。要选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性以及酶的活性大小确定适宜的酶液组合。酶的浓度不宜过高，酶解时间不宜过长，最好不超过8h。木本植物的细胞壁成分比草本植物的坚厚，含有较多的半纤维素，分离原生质体时应适当添加半纤维素酶。配制的酶液要分装在试管中，—20C冷冻保存备用。用过的酶液高速离心后冷冻保存，可以重复使用1～2次。(三)渗透压稳定剂•渗透压稳定剂主要可分为两大类：•一类是由糖醇或可溶性糖(如甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖)组成的有机溶液，目前大多采用这一类，一般使用甘露醇或山梨醇，也有的使