试验二质粒DNA电泳鉴定

实验二质粒DNA电泳鉴定生物技术制药实验武汉大学药学院实验教学中心生物技术实验室主讲教师：刘永梅刘永平实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理；学习琼脂糖凝胶电泳的操作方法实验原理及背景知识简介电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术。如DNA制备、浓度测定、目的DNA片段分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2分离原理DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系可依据DNA分子的大小使其分离DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理DNA电泳影响因素（一）DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。DNA分子构型构型不同，电泳时受到的阻力不同，导致泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。DNA电泳影响因素（二）电场强度一般约为5V/cm。分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高，分离的线性范围变窄，也会大量产热导致DNA片段的降解。选择合适电压，如对于大片段DNA的分离可选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电压以缩短电泳时间。溴化乙锭EB，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2.2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。DNA电泳影响因素（三）琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。核酸染色剂注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验材料及器材提取的大肠杆菌质粒DNA电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，电子天平，凝胶成像系统，移液器，枪头，三角瓶，点样板，微波炉等琼脂糖，TAE电泳缓冲液，载样缓冲液（Loadingbuffer），EB存储液，电泳级琼脂糖粉，DNA分子量标准微波炉——溶胶用实验仪器凝胶电泳仪及电泳槽凝胶成像系统实验准备工作配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L）1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存）10加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；1.5ml离心管、移液器吸头灭菌。实验步骤——（一）制胶（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1)，微波1min煮沸。50ml制备两块小胶。（注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉）（2）平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。（3）铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。静置10-20min。（4）待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。实验步骤——（二）点样（5）剪1片光面纸（或封口膜），将DNA样品与6×加样缓冲液5：1混合。若样品浓度较高，可加蒸馏水稀释。如3l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入2l质粒DNA溶液制成6lDNA样品。（6）将混合好的样品3-5l加入凝胶的凹孔中，同时加入1.5-3lDNA分子量标准物。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。实验步骤——（三）电泳分离及结果观察（7）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。（8）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动。电泳将进行约30min。（9）据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止。当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。（10）将凝胶放紫外灯下观察并拍照，时间不宜太长。DNA电泳图谱常用DNA分子量标准物样品电泳结果注意事项1倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形；倾倒速度不能过快，避免气泡的产生。2胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔3点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多4EB有毒，操作时需带手套，切勿用手直接接触，更不能污染环境，用过的胶勿乱扔5紫外线照射不要太久思考影响本实验结果的因素有哪些？画出电泳图谱，分析观察到的结果。