试验原理微核micronucleus微核试验

小鼠骨髓细胞微核实验环境毒理学实验——1.1环境毒理学1.引言研究环境污染物，特别是化学污染物对生物有机体，尤其是对人体的损害作用及其机理的科学。藻类生长抑制实验鱼类急性毒性实验经口急性毒性实验小鼠骨髓细胞微核实验一般毒性特殊毒性1.2环境毒理学实验——环境毒理学的研究方法水生脊椎动物浮游植物哺乳类啮齿动物1.3遗传毒性研究突变(mutation)：遗传物质发生的可改变生殖细胞或体细胞中的遗传信息并产生新的表型效应的变化。环境致突变作用化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变，可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关自发突变诱发突变化学因素物理因素生物因素环境化学诱变物药品：抗癌药物环磷酰胺、氨苯喋啶等农药：DDT,敌敌畏，谷硫磷等工业生产中应用和产生的污染物亚硝胺类，多环芳烃类，甲醛，苯，砷，铅……1.4致突变试验评定外源化合物对生殖细胞及体细胞的致突变性对遗传危害性做出初步评价用于环境诱变剂污染的监测及评价有价值的工具用来评价诱发癌症的可能性遗传毒性研究新技术聚合酶链反应技术单细胞凝胶电泳试验荧光原位杂交转基因小鼠突变试验基因芯片技术常用经典方法•Ames试验•微核试验•染色体畸变分析•SCE试验•显性致死试验根据检测的遗传学终点，可将致突变实验分为基因突变试验、染色体损伤试验、非整备体试验和DNA损伤试验。2.1实验目的学习和掌握小鼠骨髓细胞微核实验方法和嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法了解微核测试的原理和遗传毒理学在实际生活与工作中的应用范围及意义2.小鼠骨髓细胞微核试验微核形成原理微核：染色体断裂或纺锤丝受损,在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。2.2实验原理微核micronucleus微核试验：通过观察微核的形成情况来检测断裂剂及非整备体诱发剂。可以根据嗜多染红细胞(PCE)细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性。2.3实验器材1.手术刀2.手术剪3.无齿镊4.小型弯止血钳5.干净纱布6.带橡皮头吸管7.台式离心机8.刻度离心管9.电吹风机10.玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头12.载玻片及推片13.定时钟14.带油镜头显微镜15.细胞计数器16.玻璃染色缸17.晾片架2.4主要试剂甲醇（分析纯）生理盐水小牛血清pH6.8的磷酸盐缓冲液分别取1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。吉姆萨(Giemsa)染液阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C2.5实验步骤（1）实验动物及处理①实验动物品系：昆明种小鼠性别：雌性雄性各半周龄：8周体重：18-20g②染毒途径经口经皮经呼吸道注射小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射方法测试气态污染物的毒性，应优先选择哪种染毒方式？a.经口b.经皮c.经呼吸道d.注射测试主要存在于水体、食物中的化合物的毒性，应优先选择哪种染毒方式？测试化妆品主要成分的毒性，应优先选择哪种染毒方式？③染毒次数及取样时间染毒时间微核率环境毒物诱发微核出现的高峰时间：24-72h染毒次数：4次连续染毒每24h染毒1次④剂量选择染毒组阴性对照组阳性对照组最高剂量组采用该毒物的最大耐受量(或1/2LD50)在此以下再设3-5个浓度组等体积溶剂环磷酰胺50-100mg/kg丝裂霉素C100mg/kg在动物实验中不引起实验动物死亡的最大剂量或浓度(2)骨髓液的制备和涂片取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清混匀、推片推片的操作方法(3)固定涂片自然干燥后放人甲醇中固定15min。(4)染色用新鲜配置的吉姆萨使用液染色10-15min，取出后迅速用磷酸盐缓冲液(pH6.8)冲洗染色残液，晾干（5）观察计数低倍镜观察(100-400倍放大)选择细胞分布均匀、疏密适度、染色较好、形态完整的区域油镜(1000倍放大)细胞计数嗜多染红细胞和微核注意区分微核和杂质（6）数据处理和结果评价微核率计算方法结果评价阳性判断标准：实验组微核率显著高于对照组，具有重现性具有剂量-效应关系阴性判断标准：实验剂量足够大，染毒次数足够（7）质量保证/质量控制(QA/QC)阴性对照：应得到阴性结果，微核自发率约为3‰阴性对照异常的可能原因试剂被污染实验动物异常，实验前已接触遗传毒物操作错误阳性对照：应得到阳性结果，各次实验结果具有重现性阳性对照异常的可能原因无效染毒，染毒试剂已分解实验动物异常，周龄不合适，敏感度下降操作错误注意事项1.实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。2.骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。3.正确区分微核和涂片上的异物。4.实验动物年龄不宜过大。