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237实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支,小漏斗1个、80-200铜滤网1块、培养皿2个、l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。238（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。配好后倒入洗液缸中备用。新配制的清洁液呈棕红色。当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。（二）物品的清洗1、新购置物品玻璃器皿清洗步骤清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干（或50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。2、用过的玻璃器皿清洗步骤带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→刷洗→自来水冲洗→凉干（50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。2393、橡皮帽和橡皮塞的清洗新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法如下；2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2～5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用．4、塑料制品（塑料培养板、针头式加压塑料小滤器）的清洗用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签刷洗→流水冲洗→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→去离子水浸洗三次→双蒸水中浸泡24小时→晾干备用。注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开，按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，备用。5、不锈钢除菌滤器的清洗先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2～3次（去离子水浸泡24小时）→三蒸水冲洗2～3次或浸泡24小时→干燥备用。6、镊子、剪刀纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。7、金属滤网自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。实验二实验器材的包装和消毒实验用品实验一中清洗的所有物品、脱脂棉一卷/班、纱布一卷/班、高压锅一个/班、无菌操作台一台/组、牛皮纸1张/组，纸绳一卷/组、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔一个/组。实验方法（一）包装1、包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。2、瓶类：需用局部包扎，用牛皮纸包扎。随后单个或几个一起用纸包好。2403、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等）加脱脂棉，吸管、滴管，随后置玻璃吸管筒或铜制、铝制吸管筒内（内放纱布），塞上棉塞或盖上有孔盖子（内外孔对好），外包上两层牛皮纸，若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。4、带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。6、为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面注以符号或写上字“－”“＋”。（二）器皿的消毒干热消毒主要用于玻璃器皿的消毒。160℃、l20分钟，消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。湿热消毒即高压蒸汽消毒：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。消毒时间是从压力达到15磅，温度达到121℃时算起。一般蒸气消毒30分钟。橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。消毒后，调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热，而不至于激烈的沸腾。各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品l0磅l0分钟布类、玻璃制品、金属器械等15磅20分钟实验三培养用液的配置实验用品实验器材：1000ml的量筒2个，1000ml的烧杯2个，磁力搅拌器一台，玻璃棒两个，感量0.1mg的分析天平,100ml的盐水瓶若干,化学试剂:NaCl,KCl,KH2PO4,Na2HPO4.12H2O2.85g或Na2HPO4.2H2O,NaHCO3,小牛或胎牛血清,胰蛋白酶,醋酸。实验要求及方法（一）PBS液241实验室常用含0.85%,pH7.2的PBS(简称pH7.2的PBS)1.PBS贮存液配法NaCl(AR)8.5g；KCl(AR)0.2g；KH2PO40.27g；Na2HPO4.12H2O2.85g(或Na2HPO4.2H2O1.13g)溶于100ml双蒸水中。2.PBS应用液配法取贮存液50ml加双蒸水450ml即成,经103kPa(121.3℃)15分钟灭菌,置室温或4℃保存备用。3．配制BSS液的要求（l）BSS液中各试剂规格为一级GR试剂（guaranteedreagent）或二级AR（analyticreagent）试剂.（2）配制后液体呈桃红色，pH7.4左右没有混浊和沉淀。（3）含钙镁离子的物质要单独溶解.（4）可配制10倍浓度的贮存液，滤过消毒，分装，每瓶10毫升；冰箱保存。使用时每瓶加三蒸水至l00毫升。（5）配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无钙、离子的D—Hanks液，或PBS液。（二）血清灭活处理的方法:1.选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。2.对照瓶内放入与血清等体积的水。3.温度预试：使水浴锅温度保待在56℃。放入内4～5支温度计，选择2～3支温度计，4.血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至56℃时定时30分钟。5.大瓶血清灭活后进行分装。6.分装后，抽样做无菌试验，－20～－70℃保存。（三）配制合成培养基（液）注意事项。1．用三天内制备的玻璃三蒸水配制培养液2．按二周用量配制为宜，配量过多，存放时间过长会造成培养基老化、变质、产生沉淀。3．培养液中各成分是否完全溶解的判断方法：将培养液置室温或4℃冰箱30分钟后，观察瓶底有无颗粒产生。2424．根据实验需要，在培养液中加入适量37℃单独溶解的NaHCO3溶液。正常体细胞培养液中NaHCO3量为20～22克／升，肿瘤细胞为1.5～1.7克／升。5．干粉培养基不易溶于水，实验室采用空气CO2助溶法即将甲液在磁场上搅拌一段时间，当甲液pH值下降到5.8左右时（橙黄色）氨基酸和维生素基本溶解,在甲液内再加入溶解有NaHCO3的乙液，两液混和后，营养液pH值为7.0～7.1，抽滤后pH值上升0.1。此法操作简便，营养液pH值稳定。（四）胰蛋白酶液胰蛋自酶是一种黄白色粉末，水解蛋白质时作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架．从而使细胞分离。胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1:250两种,即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。一般来说，浓度越大、温度越高、作用时间越长，对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度就会损伤细胞。常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25％利0.125％，作用温度37℃或室温，pH7.4左右。Ca2+Mg2+和血清的存在都会降低其活力O.25％胰蛋白酶液的配制方法如下。l.过滤消毒法。①按实验需要称取酶粉，用少量D-Hanks液或PBS液将胰蛋白酶粉调成糊状。②加适量D-Hanks液或PBS液(橙红色)，磁力搅拌溶解③溶解后的酶液（深红色）滤过除菌，分装，-20℃冻存。2.高热消毒法。利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性对其进行高热消毒。①、按实验需要称取酶粉溶于1毫摩尔／升pH3.0的HCl中。②、酶液和2倍D－Hanks液同时在0.1兆帕，120℃条件下灭菌20分钟。③、两液冷却至室温时，等量混匀。酶液浓度高时，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，两液等体积混匀。然后用10摩尔／升的NaOH调消化液PH值至7.2（橙红色或深红色）④、经计算，消毒后酶浓度下降50％。如消毒前酶浓度为0.1%～0.5％，消毒后为0.05％～O.25％。高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。（五）PH调整液1、NaHCO3溶液常用的浓度有7.4％、5.6％、3.7％三种，配制时37℃三蒸水溶解后通过滤膜过滤除菌，分装于安瓶中4℃冰箱保存，每支一次用完。使用时，NaHCO3液要逐滴加入，并不时搅动培养液。以防pH值过高。2432、10％醋酸液高压灭菌,分装，4℃冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO3液。（六）200毫摩尔／升L-谷氨酰胺L－谷氨酰胺2.9222克（M=146.15），加适量50℃三蒸水溶解．定容至l00毫升，滤过除菌，1毫升／安瓶，一20℃保存使用时每l00毫升培养基中加1毫升谷氨酰胺。（七）抗菌素液加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。青霉素、链霉素液又称双抗溶液。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。（八）细胞用液的分装要求l.使用严格无菌操作。尽量减少试剂在空气中的暴露时间。2.根据配量准备分装瓶和瓶塞，分装瓶规格、数量应根据实验需要准备。避免因包装瓶过大、贮液时间过长或反复冻融使用造成营养成分丢失和微生物污染。按一次用量或一周内用量挑选小包装瓶。融化后的液体置4℃保存。3.分装前做好分装量标记，分装瓶内液体量要小于瓶容积的2／3。4.做好分装瓶标记，包括试剂名称、浓度、配制日期、组号。※采用边过滤边分装的方法。瓶口的液体用干酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包装。实验四组织细胞的原代培养实验操作要领和注意事项（一）原代细胞培养操作要领1、原代细胞混匀操作要领①火焰消毒吸管，用Hanks液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。②吸管头插入管底。③用吸管反复轻轻吹打组织块。2、器械的使用操作要领①用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。244②器械置无菌干纱布内擦一下，迅速通过火焰，冷却后使用。③用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。④器械按浸泡消毒的顺序