全国结核病细菌学诊断培训

2006年10月全国结核病细菌学诊断标准培训结核病流行和防治策略端木宏谨北京结核病胸部肿瘤研究所与结核病细菌学实验室诊断相关的结核分枝杆菌生物学性状要略潘毓萱结核病实验室工作质量保证姜广路国家结核病参比实验室生物安全柜的使用王秋娣中国疾病预防控制中心诊断试验研究与评价史红中华检验医学杂志编辑部结核菌涂片、培养的标准化操作刘宇红国家结核病参比实验室消毒和灭菌胡继红卫生部临床检验中心结核病实验室诊断进展赵雁林国家结核病参比实验室我国结核病防治形势与任务肖东楼卫生部疾病预防控制局全球结核病负担俄罗斯1%印度尼西亚10%孟加拉4%巴基斯坦4%尼日利亚3%菲律宾s3%南非2%中国15%印度30%其他国家28%我国多达5.5亿的人口感染过结核菌2004年WHO估算•活动性肺结核病1460万人•涂阳610万人•新发结核病890万人•新涂阳390万人•死于结核病170万人（我国：37万，居法定传染病之首）结核病控制三大目标：1.近期目标：到05年，病人发现率达70%，治愈率达85%，DOTS覆盖率达100%2.中期目标：到2010年，结核病患病率和死亡率在1990年的基础上各下降50%3.长期目标：到2050年，基本消灭结核病，发病率1/1百万病人减少百分比=发现率×治疗覆盖率×完成治疗率×治愈率0.4×0.9×0.9×0.9＝0.5×0.9×0.9×0.9＝0.6×0.9×0.9×0.9＝0.7×0.9×0.9×0.9＝0.290.360.440.510.3×0.9×0.9×0.9＝0.22现代结核病控制策略政府承诺开展以痰检为主的病人发现工作应用标准短程化疗并实施督导管理建立正规的药物供应系统建立监测系统结核病控制是由政府提供给大众的卫生服务－NTP（nationalTBcontrolprogram）卫生部国家CDC国家参比实验室省卫生厅地市卫生厅县卫生局省CDC（结防所）地市CDC（结防所）县结核病防治机构省参比实验室地市实验室县结核病实验室NTP我国结核病实验室工作网络的组织管理（疾控）NTP中主要的实验室工作涂片镜检简单、快速、最具成本/效益培养比涂片更敏感、特异可以获得培养物药物敏感性试验及鉴定用药参考流行病学评价抗酸性的基本特性：1.属特异性富脂质网状胞壁结构α烷基β羟基脂肪酸分枝杆菌分支菌酸碳链28~40棒状杆菌分支菌酸碳链40~60诺卡氏菌分支菌酸碳链60~902.变异性培养条件：丙三醇糖苷组织内环境不同菌状态3.抗酸性是分枝杆菌属特异性不能作为分枝杆菌种水平鉴定的生物学指标涂片染色镜检相关的生物学性状传统萋尼氏染色法（1882）TamThiamHok法（1962）1.碱性复红5克1.碱性复红20克酚25克酚40克乙醇95%50毫升乙醇95%100毫升蒸馏水500毫升蒸馏水500毫升热染3分钟冷染3分钟2.乙醇95%970毫升2.亚甲兰5克浓盐酸30毫升乙醇95%150毫升蒸馏水250毫升硫酸96%100毫升3.孔雀绿2.5克亚甲兰2.5克苦味酸3.5克蒸馏水500毫升分枝杆菌的形态多样性：Bergy’sMannualofSystematicBacteriology典型描述：杆状，0.3-0.6×1-4μm,直或稍些弯曲，单个，偶呈串状，染色均匀或不规则，常见异染质，有分枝样生长或集簇倾向形态多样性：陈旧培养物淋巴结，干酪组织内呈生理多样性和形态多样性杆菌相（型）：抗酸性+++短杆状++-+++丝状+/±球菌相（型）：诺卡氏菌胞壁缺陷型+/±/-李斯特菌胞壁缺陷型±/-颗粒相（型）：-滤过相（型）：-细菌学限制：形态多样性和可培养性抗酸性镜检阳性依据分离培养典型杆状+++短杆状+？+球状、丝状+、±-？胞壁缺陷部分缺陷±-？完全缺陷L-型--？颗粒±/---莫赫颗粒---滤过型---菌形态多样性排菌间歇性痰样本中菌分布不均匀性结果：常规涂片染色镜检是以正常杆菌形态为阳性判定标准出现漏检的假阴性影响涂片染色镜检的因素抗酸性的属特异性假阳性抗酸性变异性假阴性形态多样性假阴性均分布不均匀性假阴性低敏感度涂阴培阳结核菌涂片镜检、分离培养标准化操作1、对象结核病可疑者咳嗽、咳痰超过3周咳血或伴有血痰发热或胸痛超过2周胸部X线异常确诊并正在接受治疗的结核病人2、痰标本收集容器：广口、螺旋盖、可密闭、不易泄漏标本性状：干酪痰、血痰、粘液痰、唾液采集时间：即时痰、晨痰、夜间痰3、标本接收和登记检查标本性质，不合格的痰标本可以要求病人重新留取核对申请单和痰盒上的标本信息登记在实验室记录本上4、材料的准备痰盒玻片（一端带有磨砂边）竹（木）签定时器染色池、染色架酒精灯加热棒玻片盒废料缸漏斗（滤纸)镊子染色液镜油、镜头纸5、涂片编号涂抹痰标本自然干燥2cm1cm2verticallines,1cmeach=100fields不得使用火焰加热的方法加速痰膜干燥×太厚适宜太薄痰膜的厚薄6、染色萋尼氏热染色法加热固定石炭酸复红初染盐酸酒精脱色美兰复染非抗酸菌初染脱色复染抗酸菌加热固定将涂片排放在染色架上，注意间隔滴加碱性复红滴加碱性复红染色液，铺满玻片*FloodingSlideswithCarbolFuchsin加热HeatingofSlides流水冲洗WashingtheSlideafterCarbolFuchsin盐酸酒精脱色DecolourizingwithAcidAlcohol流水冲洗脱色液WashingtheSlideafterDecolourizationwithAcidAlcohol亚甲兰复染CounterstainingwithMethyleneBlue流水冲洗亚甲兰WashingtheSlideafterMethyleneBlue沥去玻片上的水，自然干燥DryingtheStainedSlides太厚太大、不均匀太大、不均匀、脱色不佳涂片不佳、不均匀太小脱落脱落太薄不均匀、脱落、脱色不佳7、镜检在油镜下，至少检查300个（100个）有用的和有代表性的视野（至少5分钟）荧光染色镜检FM比ZN镜检法的特异性差因此FM阳性结果应该利用ZN进行确认FM方法可以阅读更多的涂片，适用于标本量较多的实验室8、结果报告阴性未发现抗酸菌/300视野报告实际菌落数1-8条/300视野阳性1＋1-9条/100视野阳性2＋1-9条/10视野阳性3＋1-9条/每视野阳性4＋达到或超过10条/每视野结果标准每毫升痰液菌量实际菌数1-8条/300视野5,0001＋1-9条/100视野30,0002＋1-9条/10视野50,0003＋1-9条/每视野100,0004＋=10条/每视野500,000涂片阳性的意义？涂片阳性说明病人痰标本中含有大量的抗酸菌，是最主要的传染源。9、玻片的保存去除镜油保存近期三个月量痰涂片按实验序号存放于玻片盒中，置干燥阴凉处保存假阴性假阳性技术错误涂片太薄/太厚、暴露在紫外线下标本中的混杂物质/加热时间过长/使用污染的木签染色染色质量不佳、未热染、染色时结晶/环境抗酸菌、间太短、脱落、涂片未固定交叉污染脱色脱色不佳脱色不佳复染过染染色不佳镜检员视力缺陷、仅观察少数视野经镜油交叉污染读片错误未经培训未经培训记录/报告笔误、标签错误笔误、标签错误产生错误结果的因素分离培养相关的生物学性状分离培养相关的生物学性状Bergy’sMannualofSystematicBacteriology倾向蜿蜒索状生长大多数固体培养基上菌落粗糙，突起，致密，常有小结节、褶皱表面和不规则的边缘，常呈白色、暗黄色或黄色，在无表面活性剂液体培养基中静止培养，呈膜生长，随着菌龄增加膜加厚、皱褶；在含Tween液体培养基中震荡培养可分散生长，无扰动机群可分散；试管内代期（generationtime)最适条件下14~15h可生长温度30~34℃，最适生长温度37℃最适pH6.4~7.05%CO2,0.5%丙三醇促进早期生长有氧条件下培养物急剧转向无氧条件，菌快速死亡，氧梯度逐步降低，可适应氧饥饿，在液体培养基中可呈同步生长；营养要求简单无机合成培养物中可生长具有合成生长所需要的全部氨基酸、维生素、辅酶因子的基因Koch时代培养基凝固血清、马铃薯切块、营养明胶、营养琼脂营养要求研究；快速培养（？）提高检出率现代培养基：强化半合成液体培养基7H9,11固体培养基（天然营养物）:罗氏鸡卵培养基7H10琼枝培养基生长缓慢特性-----------------------------------------------------------------------------------------------指标结核耻垢大肠------------------------------------------------------------------------------------------------代期(小时)试管15~2430.5巨嗜细胞15~60家兔角膜20~22菌落形成时间（1mm）4周数日隔夜亲脂性胞壁屏障+++-核苷酸参入(核苷酸/分钟)3200快11倍快13~18倍基因组DNA复制时间(小时)10~181.8~1.9mRNA转录时间(小时)0.120.013rRNA操纵子数127核糖体数170020,000调控?----------------------------------------------------------------------------------------------------酸性罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基天门冬素3.6g或谷氨酸钠（纯度99%以上）7.2gKH2PO414.0gMgSO4.7H2O0.24g枸橼酸镁0.6g丙三醇12ml蒸馏水600ml新鲜鸡卵液1000ml2%孔雀绿20ml一、培养基原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：-尽可能杀灭标本中的杂菌-尽可能保存标本中的分枝杆菌二、标本前处理操作痰标本1－2倍4%NaOH振荡匀化静置15分钟37℃竖直培养8周均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时三、接种和孵育接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况此后每周观察一次，直至满8周记录菌落生长及污染情况。四、结果的观察与报告结核分枝杆菌生长特性：缓慢：在一般培养基上分裂一代需要10多小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。报告方式分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）涂片后标本于冰箱保存，24小时内培养。标本选择不当选择标本中脓样、干酪样可疑部分过处理（时间、浓度)4％NaOH，1－2倍体积，20分钟接种量太小每管接种0.1毫升温箱温度不当温箱内置温度计，每日监测温度。涂阳培阴率过高？可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）涂片留取后24小时内培养，不能及时培养的4C冰箱保存。前处理不充分4％NaOH，1－2倍，充分混旋，20分钟。材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。操作不当培训，严格按操作规程操作。培养基因素统一供应，4C直立保存，1个月内使用污染率过高？痰涂片镜检质量保证体系质量保证(QA）：质量控制（QC）室间质量评估（EQA）现场评价盲法复检批量测试质量提高（QI）室内质量控制措施SOP自查试剂的质控（染色液）工作应有详尽记录室间质量评估(EQA）与