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本期精彩内容疫苗： 疫苗的储备――引言 大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗 使用基于生物传感器的Biacore分析以应付当 前疫苗开发中的分析挑战 应用WAVE生物反应器快速生产临床级别的T淋 巴细胞（Tcellcultureinwave） Baxter新闻BaxterusescellcultureforH5Nvaccine• Novavax新闻NoVaaxGEhealthcare的新应用： 用PreDictorplates对MabSelectSuRe的单克隆 抗体pH洗脱的高通量筛选(28927792) 层析工艺中的介质清洗以及清洗验证(82457)CaptoBlue层析介质 新介质(28936960)CaptoMMC层析介质 新介质(003545)VIIIselect介质用于重组VIII的分离 新介质 (28966237)AVBsepharoseHighPerformanceAVV病毒纯 化的新介质 新介质avbsepharoseforAVVUpstreamandDownstream•SupplementDecember20072疫苗储备虽然疫苗接种计划使全世界每年数百万人免于死亡，然而仍有百万计的人由于缺乏疫苗而受到死亡的威胁。严格的疫苗生产规章制度和较低的投资回报率阻碍了制药公司进入这个市场。事实上，几年来疫苗生产商的数量在下降。但现在形势正在发生转变。世界发展中国家的困境已经吸引了盖茨基金会、全球疫苗和免疫联盟、PATH和其他著名机构的关注，这促进了全世界范围的疫苗计划以抵抗如疟疾、埃博拉病毒、HIV和丙肝等疾病。在发达国家中，大流行疾病威胁如流感、禽流感、SARS和生物恐怖袭击促使政府制定计划储备疫苗，或储备疫苗快速生产能力以确保疫苗供应。改变的主要推动力是大流行禽流感的威胁。在2006年的一份报告中，WHO设定到2009年全世界20亿人份的目标，而更长远的计划是67亿人份。最新的规划目标更高。然而当前全球的生产能力只有3.5亿人份。这些挑战将怎样被克服呢？由于大流行疾病能够冲击任何地方和人群，真正的挑战是能够供应足够的储备疫苗或立即生产出可用的疫苗。解决方法是建立新的疫苗生产厂；或建造可移动的生产车间。只是建立新的工厂并不够。现有的生产工艺并不令人满意，比如疫苗安全性、耐受性和改进疫苗效力并增加生产效率。例如，流感疫苗传统上一直是鸡胚生产，然而这是费时费力的生产方法，产品质量控制困难。疫苗生产厂商必须考虑其他可选择的技术，例如基于哺乳动物细胞的培养，它更容易自动化和生产放大。新的疫苗基于重组蛋白的最新技术，例如那些针对癌症、人乳头瘤病毒和脑膜炎的疫苗已经进入市场并促使形势改变。其中一些疫苗成为了重磅炸弹，从而成为新疫苗的催化剂。任何疫苗的供应，无论是针对大流行或季节性流感的爆发，都需要厂商具有强大的生产能力，严格的生产供应链和质量体系，才能快速满足市场的需求。随着新候选疫苗出现、制造工艺的改良和生产能力的增加，疫苗生产商能更好地应对疾病挑战，但距离WHO的目标还有一段距离。1全球性全国性流行感冒行动计划增加疫苗供应:2006年9月数据由BaxterBioScience疫苗开发组友情提供。ManfredReiter和WolfgangMundt工艺开发,BaxterBiomedical研究中心Orth,奥地利大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗流行性感冒是一种病毒引起的呼吸系统疾病，在人群中导致高发病率和显著的死亡率。随着20世纪40年代流感疫苗的推广，流感疫苗已经明显减低了发病率。流感疫苗是三价的，目前的组成含有A型流感病毒菌株亚型HN、H3N2及B型流感病毒菌株。传统用于疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养。使用这种传统的方法不得不对几百万个蛋胚逐一接种和收获。生产过程很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。流感病毒能够在多种动物细胞内繁殖, Baxter公司专注于Vero细胞，一种可传代的猴肾细胞，其特征如表1所述。表1.Baxter的Vero细胞平台背景资料来源:细胞库:从ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)获得的非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)肾细胞ATCCCCL8，988年，传代数为24MCB(主要种子细胞库)传代数为28 (全面检测为无致瘤性、无外源因子，同源一致性/遗传学稳定性)WCB(工作种子细胞库)传代数为33标准质量控制检测项目：-细菌和真菌无菌检测-支原体-外源因子UpstreamandDownstream•SupplementDecember20074Vero细胞在过去的二十多年里已获准用于生产人用疫苗(例如脊髓灰质炎和狂犬病疫苗)。虽然Vero细胞对多种病毒敏感，可是最初流感病毒在Vero细胞上的努力失败了(，2)。BaxterHealthcare现已开发出一种能够生产高效价的季节性流感和禽流感人用疫苗的技术(表2)，也可以生产大多数其他的人用和兽用疫苗(表3)。在文献(3，4，5)中描述了Vero细胞技术用于疫苗开发和生产的原理和前景。大流行流感疫苗制备禽流感病毒(H5N)向人类的快速传播和蔓延已经在世界上引起对新流行性病毒的恐慌，更加担心流感疫苗生产方法和能否快速生产和储备出足够的疫苗。Baxter现已开发出一种成熟稳定并且灵活的生产策略，它使用生长在Vero细胞中的野生型病毒。野生型全病毒疫苗诱导和加强包括细胞免疫H5N特异性免疫应答(在H5N特异性应答中，疫苗中不含有PR8、核蛋白和膜蛋白)。我们的大规模生产数据证实了在短期内快速、高产量地生产大流行流感疫苗是可行的。表2.Vero细胞不同流感病毒株的血凝素效价亚型 宿主 病毒株 血凝素单位HAUHN人类A/PR/8/34256人类A/USSR/90/77256猪A/Swine/976/3256鸭子 A/Duck/Bavaria/2/77256人类 A/Singapore//5728H2N2人类 A/HongKong//6828猪 A/Swine/HongKong/3/7628猪 A/Swine/HongKong/27/82256鸭子 A/Duck/HongKong/24/75256H3N2鸭子 A/Duck/Singapore/3/97256H5N3家禽 256H7N 家禽A/Quail/Hongkong/G/9728人类A/Hongkong/073/99256H9N2人类 A/Vietnam/94/2004024人类 A/Vietnam/203/200024人类 A/SP83/2004(Thailand)52人类 A/Indonesia/05/2005024家禽 A/Turkey/Turkey//2005024家禽 A/Chicken/Egypt/3/2006024H5N微载体辅助大规模Vero细胞技术驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养基内生长。带有详细传代记录的Vero细胞冻存管被复苏；并传代到T形瓶和滚瓶中，生产出足够数量的细胞以接种Cytodex™3微载体生物反应器。细胞汇合后，细胞按照大约:7的比例传代到后面的生物反应器。最终的细胞密度在2-3×06/ml。中试生产中最终的生物反应器规模是200升。包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大到生产体积为6000升。在所有的生产开发过程中，从小量实验生物反应器到临床和商业化的生产用反应器，Vero细胞表现出相同的工艺水平(表4)。表3.Vero细胞对不同病毒的敏感性 流感病毒(粘病毒) 天花ACAM-2000(痘病毒) SARSCoⅤ(冠状病毒) 肝炎A病毒(小核糖核酸病毒) RossRiver病毒(α病毒) 日本脑炎病毒(黄病毒) 西方尼罗河病毒(黄病毒)Chikungunya病毒(α病毒)病毒:表4.在Cytodex3上的Vero细胞工作体积和传代水平接种细胞0.20.2*0.2*0.2*38第一个生物反应器0.72.0242039.5第二个生物反应器4.64.3709504第三个生物反应器3200200600042.5 体积(L) 传代数*多个滚瓶图1.在20L(A) 、950L(B)和6000L(C)反应器中Cytodex3微载体上生长的Vero细胞。Vero细胞大规模生产潜能贴壁依赖性Vero细胞生长达到很高的细胞数，最大规模6000 L的批次培养能获得.8×03个细胞。商业生产中使用多个并行的生物反应器。Vero细胞在不同规模的生物反应器内贴附在Cytodex3微载体上生长的照片如图1所示。Vero微载体细胞培养工艺放大到最大的生产规模中验证有效，测定了代谢参数如残留葡萄糖和氧消耗速率图。图2提供了连续运行的实例。02040608000204023660IB/SD97/O/03/07IB/SD97/O/03/0IB/SD97/O/03/400,5,522,533,544,55023456IN/O/03/05IN/O/03/06IN/O/03/07IN/O/03/08IN/O/03/09IN/O/03/0IN/O/03/IN/O/03/2IN/O/03/3IN/O/03/4IN/O/03/5AB葡萄糖(第三个发酵罐)葡萄糖[g/l]天％OUR耗氧速率时间(小时)图2.在最终生产规模为6000升时Vero细胞培养的代谢图。(A)在多轮运行的灌注培养中代谢的葡萄糖浓度，(B)在病毒繁殖期的相对氧消耗速率。UpstreamandDownstream•SupplementDecember20076ABC图3.大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片。(A)未感染的细胞，(B)早期细胞病变影响，(C)收获前的晚期细胞病变。大规模流感病毒生产工艺为生产病毒，使用42.5代数的Vero细胞接种不同的病毒株，MOI为0.0TCID50/细胞。病毒吸附小时，然后加入胰酶并在32℃－35℃下进一步孵育48-72小时。大流行流感疫苗和季节性流感疫苗的病毒株都能在这些条件下生长。病毒生产动力学和细胞病变效应的评估(图3)使得我们能够建立一个稳定的且可重复的生产工艺。大流行流感和季节性流感疫苗的生产工艺用于生产的病毒株的准备是关键的一步。病毒扩增按三步进行，命名为病毒种子库、工作库和生产库。这使得我们可以确保一种为商业生产持续和长期的病毒供应。最后，生产病毒库被用于感染6000升规模的生物反应器生产，紧接着进行许多已经建立完善的下游单元操作(图4)。在滚瓶中的接种准备（代数33－38）在Cytodex3微载体上的细胞扩增（生物反应器步骤、2、3）病毒繁殖（裂解过程）细胞分离（收获）灭活（福尔马林和UV）蔗糖梯度纯化（纯化－）超滤洗滤（纯化－2）制剂和填充（多种菌株混合）图4.Vero细胞流感疫苗生产图5.流感疫苗生产的大规模生产区域。(A)细胞培养(B)离心分离，(C)超滤、洗滤。微载体上汇合了的Vero细胞，用不同的亚型病毒株感染，再培养2-3天。用连续流离心收获和细胞分离澄清，上清液中含有病毒。活病毒用福尔马林处理并应用UV照射进行第二步灭活步骤。灭活的病毒进一步通过连续的蔗糖密度离心纯化(纯化-)，去除可溶性的宿主细胞蛋白。这中间产物称为纯化的病毒，并含有大约42%的蔗糖浓度。超滤减少蔗糖浓度并完成精细纯化(纯化-2)。这步的最终产物称为单价疫苗。最后不同的单价疫苗被无菌混合制剂和填充成最终的疫苗针剂。在图5中显示6000升规模的发酵、离心和超滤的生产区域。Vero细胞季节性和大流行流