8生物芯片技术简介

生物芯片技术BiochipsTechnology教学要求•掌握：1基因芯片的设计原理和基本方法2各种芯片的使用及意义•了解：1各种芯片的分类特点2基因芯片的操作及结果分析•芯片原指内含集成电路的硅片，体积很小，常常是计算机或其他电子设备的一部分芯片的基本概念生物芯片主要指通过平面微细加工技术，在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。FoodtestingLivestockdiagnosticsorgradingAgriculturalbiotechHumandiagnosticsEnvironmentaltestingBasicResearchIdentitytestingPersonalizedmedicineDrivingtheGeneticRevolution芯片简介微阵列芯片（Microarray）生物芯片分类基因芯片蛋白芯片组织芯片微阵列技术微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片，则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。基因芯片是通过微阵列技术,将高密度DNA片段，进行荧光标记，然后以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。何谓蛋白芯片？•蛋白芯片：将多种蛋白质以微阵列的形式固定在固相或液相支持物上，在孵育反应中与样品中靶分子的结合，并用报告分子检测结合信号。•抗体芯片：将不同抗体按照类似基因芯片的方法点阵在特定的片基上，通过抗原抗体结合来对检测样品中的蛋白作定性和定量分析。作用：可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度什么是组织芯片？定义：将数十个、数百个乃至上千个小的组织片整齐地排列在载体上（通常是载玻片）而成的微缩组织切片,它是一种高通量、多样本的分析工具。RNA蛋白质转录翻译细胞表型生物表型复制逆转录(病毒中)Oligo芯片,CpG-岛芯片，CGHcDNA芯片Oligo芯片蛋白芯片组织芯片芯片技术的应用？？？1.SNPs2.拷贝数3.DNA修饰1.开/闭2.拷贝数3.剪接分析1.酶分析2.拷贝数3.蛋白修饰1.细胞形态2.细胞功能3.细胞生长PCR-测序SouthernblotFISHNorthernblotRT-PCRRNase保护WesternblotELISA质谱分析组织培养组织学免疫组织学生物学中心法则—分子生物学的基本原理DNA(一）基因芯片基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray基因芯片分类按功能划分基因组芯片检测某一基因是否存在，若存在，拷贝数是多少。探针是DNA.表达谱芯片确定基因表达的途径与表达产物。探针是RNA或cDNA。测序芯片通过探针与微阵列的配对分析获得探针的序列结果。按探针类型划分cDNA芯片：几百到上千个碱基Oligo芯片:25mer(affymetrix)；70mer(Operon)；80mer（Clontech）用GeneChip作为主要研究手段发表在国际杂志的研究论文020040060080010001200199319951997199920012003基因芯片研究的总体方案图象扫描/结果分析杂交/洗涤芯片标记好的样品点样（针点或喷点）探针标准化Oligo探针合成Oligo探针序列确定基因组序列分析组织样品目的细胞总RNA提取cDNAmRNA基因文库构建目的基因扩增PCR产物纯化TheProcessCellsPoly-ARNAAAAAcDNALLLLIVT10%Biotin-labeledUracilAntisensecRNALFragment(heat,Mg2+)LabeledfragmentsHybridizeWash/stainScanLGenechipsforgenesexpressionanalysis•Standardeukaryoticgeneexpressionassay.ThebasicconceptbehindtheuseofGeneChiparraysforgeneexpressionissimple:labeledcDNAorcRNAtargetsderivedfromthemRNAofanexperimentalsamplearehybridizedtonucleicacidprobesattachedtothesolidsupport.BymonitoringtheamountoflabelassociatedwitheachDNAlocation,itispossibletoinfertheabundanceofeachmRNAspeciesrepresented.Althoughhybridizationhasbeenusedfordecadestodetectandquantifynucleicacids,thecombinationoftheminiaturizationofthetechnologyandthelargeandgrowingamountsofsequenceinformation,haveenormouslyexpandedthescaleatwhichgeneexpressioncanbestudied.Formoredetailedinformation,reviewtheGeneChipExpressionAnalysisTechnicalManual.TheResultAlightsourcescansthearray,causingthedyestofluoresceTheglowispickedupbyasensorandisusedtodeterminetherelativeabundanceoftheRNAThisinformationmustbeprocessedtodeterminethelevelofactivityforeachexpressedgene基因芯片的应用案例1基因芯片在抗癌中药紫龙金片二次开发中的应用•中医药擅长于从整体上进行功能的调节，在作用方式上具有多成份、多环节、多靶点的特性。这些复杂的特点，以往的药物研究方法，很难从整体到细胞水平，甚至是蛋白质水平进行全面地研究。•用基因表达差异谱数据库筛选现代中药，为中药现代化研究提供了一个全新的思路和方向。该方法将中药与现代基因组学的疾病相关基因表达和现代药物学化学物质的作用在功能上统一起来，能够在中药和基因表达之间架起一座桥梁，在基因表达水平上解释中药理论和中药的作用机制。•这样可使中药成为作用机制明确、物质基础清楚的药物，使中药理论成为人们可以普遍接受的国际医药学语言，使中药从根本上实现现代化、国际化。基因芯片在抗癌中药紫龙金片二次开发中的应用•采用人类全基因组表达谱芯片技术，建立筛选模式生物体系，破解中成药紫龙金片对人肺癌细胞株基因的作用机制以获取肺癌预测和诊断所需分子标识，探索紫龙金片作用的生物途径。实验所用细胞株：肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种基本类型，实验选取五株细胞，进行紫龙金表达谱实验。•非小细胞肺癌的–人腺癌肺癌细胞（A549）–人肺鳞癌细胞（H520）–人大细胞肺癌细胞（H460）•小细胞肺癌–人小细胞肺癌细胞（H446）–人正常细胞人胚肺成纤维细胞（MRC-5）（均购自中国医学科学院肿瘤细胞库）紫龙金药物溶液浓度7个浓度–用各种细胞的培养基配置实验药物并梯度稀释，浓度分别为：•133mg/ml•66mg/ml•33mg/ml•22mg/ml•16.5mg/ml•8.25mg/ml•4.125mg/ml细胞生长试验•培养好的细胞+不同浓度的药物处理细胞•测OD550值，观察药物处理效果A549H520H460H446药物处理结果00.511.522.533.544.5513266332216.5Blank药物浓度（mg/ml）OD值A549H520H460H446药物处理时间梯度实验结果00.511.522.5324h48h72h96h时间（h）OD值A549H520H460H446Growthinhibition01020304050607080901001.62.23.36.6A549H460H520H44616HBEMRC-5细胞生长抑制率．A549、H460、H520、H446、16HBE、MRC-5每株细胞加紫龙金药处理24h，浓度分别为16mg/ml、22mg/ml、33mg/ml、66mg/ml．总RNA提取电泳图A549-22A549-BH460-22H460-BH520-22H520-BH446-22H446-BMRC-5-22MRC-5-B表达谱试验操作芯片扫描全景图芯片扫描左上角放大图层次聚类分析图•差异显著并具有相同变化趋势的基因483个，其中上调基因170个，下调基因313个。•按功能进行聚类分析后将差异表达的基因分为63个大类，发现其主要涉及细胞生理过程的正负调控、代谢、胞内细胞器、膜结合细胞器、细胞核、细胞周期和转录等。•根据已知数据库信息，进一步将63大类，归纳为25个通路。•对具代表性的3个通路（细胞凋亡通路、细胞周期通路、Wnt信号通路）中的13个相关基因进一步研究，发现–药物处理前这5株肺癌细胞中有6个基因表达为上调，其余7个基因表达为下调；–药物处理后表达模式发生逆转，上调的基因转为下调，下调基因的转为上调证明了紫龙金药物的药效和对基因表达的调控作用。•这13个基因在给药前后的变化为我们筛选肺癌基因分子标识和寻找药物作用靶点提供了可靠证据，也有助于在分子水平上阐释紫龙金片的作用机制。表3.3个通路中的13个基因在4株肺癌细胞中经紫龙金药物处理前后的变化趋势PathwayProbesetGenesymbolFoldchangeFoldchangewithoutdrugtreatmentwithdrugtreatmentA549H446H460H520Apoptosis223556_atHELLS-3.694.392.621.903.33Apoptosis227350_atHELLS-4.833.213.002.242.91Apoptosis201466_s_atJUN11.76-5.48-3.01-15.8-6.16Apoptosis206536_s_atXIAP5.851.12-1.32-1.15-1.20Cell_cycle238977_atMCM6-4.055.507.219.418.49Cell_cycle204159_atCDKN2C-11.711.364.401.592.34Cell_cycle205034_atCCNE2-5.171.292.131.902.14Cell_cycle212109_atHN1L-3.672.031.581.652.12Cell_cycle226157_atTFDP2-3.921.311.25-1.411.28Cell_cycle202769_atCCNG22.95-3.01-1.61-2.70-1.77Cell_cycle203725_atGADD45A9.79-7.01-2.64-5.85-4.21Cell_cycle202284_s_atCDKN1A4.35-5.11-7.16-9.51-6.95Wnt_signaling217173_s_atLDLR3.39-3.61-2.06-1.83-2.01Wnt_signaling204420_atFOSL110.84-3.81-3.88-3.79-4.34Wnt_signaling201466_s_atJUN11.76-5.48-3.01-15.8-6.16案例2致病微生物检测——奶粉中重要致病菌检测基因芯片的研制奶粉致病菌检测的必要性•奶粉营养丰富，在加工和运输过程中很容易被微生物感染•