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细胞工程CELLENGINEERING——改造和培养细胞、组织、器官、个体的工程刘广发2《细胞工程》主要内容（1）•细胞工程的基础知识与基本技术；•植物组织培养；•悬浮细胞培养和次生代谢物生产；•花药及单倍体植株培养；•原生质体制备与细胞融合；•人工种子制备；•植物脱病毒技术；3《细胞工程》主要内容（2）动物细胞与组织培养动物细胞融合细胞重构与动物克隆淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体染色体转移与基因转移人类干细胞研究原核细胞的原生质体融合真菌细胞的原生质体融合4参考文献•自编.细胞工程讲义•罗立新等.细胞工程.华南理工大学出版社，2003•李志勇编著.细胞工程.科学出版社，20035探究式自主学习计划•自愿组成学习小组，3人左右，选出组长；•每组选一个主题，时间约10min；•各组需准备PowerPoint;•各组最高可得8分；•其他同学可提问、补充或更正；•教师讲评和讨论；6探究式自主学习安排（已选）顺序课题学习小组1单倍体植物的诱发和利用罗应学2动物细胞融合高嘉3植物脱病毒技术周立4淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体蒙冰5人类干细胞研究王恒6细胞重构与动物克隆杨欣蔷787探究式自主学习安排（2）顺序课题学习小组8动物细胞与组织培养9动物细胞融合10细胞重构与动物克隆11染色体转移与基因转移12人工种子制备13原生质体制备与细胞融合（植物）14原核细胞的原生质体融合15真菌细胞的原生质体融合8细胞工程的三个层次•细胞水平：细胞培养,细胞融合，整株培养；•细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞器；•基因水平：基因转化；9开展细胞工程的意义•研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及其特点；•有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良品种的步伐；•可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组织或生物；•有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产；•可获得脱毒植物；10第一章细胞工程发展简史一.植物细胞工程•1902德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具全能性；•1904德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长成植株；•1922Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺绿的叶和根；•1930-34李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏胚正常生长；•1934美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠根尖病毒愈少；11植物细胞工程•1935-36中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长；•1937美国White发现VitB促进离体根生长，指出IAA能调控生长；•1937美国Michel首创用0.5MNaNO3融合两个植物细胞原生质体；•1941Overbeek以椰子乳加入培养基，成功培养曼佗罗幼胚；•？Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比例低则生根；12植物细胞工程•1956Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三万倍；•1958Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体和植株；•1953Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养；•1960英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体；•1964印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织；•1968Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；13植物细胞工程•1972Carlson用NaNO3成功融合不同烟草的原生质体；•1977Kao（高国南）首创PEG-高钙高pH值细胞融合法；•1978Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物；•1985Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国、日本和法国相继开展人工种子研制；14二.动物细胞工程•1885Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天；•1903Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月；•1907美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长出轴突；•1914Tomson创立能在培养基中维持器官小块的方法；•？Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可无限生长；15动物细胞工程•1940Earle建立可无限传代的小鼠结缔组织L系；•1951Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系；•1958冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合；•1960s童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植，获核质杂种鱼；16动物细胞工程•1960Barski成功进行小鼠细胞融合实验；•1965Harris用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞；•1967Weiss发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失；•1975Kohler&Milstein创立淋巴细胞杂交技术，获单克隆抗体；•1997英国Willmut以体细胞成功克隆“Dolly”羊；•1998年，人类胚胎干细胞被首次培养成功；•1999年，日本医学家宣布，实现人肝细胞在体外增殖；17第二章细胞工程的基础知识与基本技术一.基础知识1.原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。2.真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。18二.基本操作1.无菌操作概念与技术无菌室布局、卫生、消毒、超净台19基本操作2.细胞培养取样灭菌培养传代收获除菌取样3.细胞融合原生质体融合筛选4.转基因细胞（个体）20第三章植物细胞工程•植物组织培养；•悬浮细胞培养和次生代谢物生产；•花药及单倍体植株培养；•原生质体制备与细胞融合；•人工种子制备；•植物脱病毒技术；主要内容：21第一节植物组织培养在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。22植物组织培养过程离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化芽根植物体培养23植物组培基本过程24配MS培养基1.基本组分：mg/L蔗糖3%,KNO31900,NH4NO31650,CaCl2440,MgSO4370,KH2PO4170,2.微量无机物：Na2•EDTA37.3,FeSO427.8,MnSO422.3,ZnSO48.6,H3BO36.2,KI0.83,Na2MoO40.25,CoCl20.025,CuSO40.0253.微量有机物：mg/L肌醇100，腺嘌呤5，甘氨酸2，烟酸0.5,吡咯醇0.5，硫胺素0.1，生物素0.01，激动素(KT)0.04—10吲哚乙酸（IAA）1—304.Agar10g/L预备阶段（1）25•6-苄基腺嘌呤（6-BA）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸馏水稍加热使其溶解；•萘乙酸（NAA）：先用少量95%乙醇和少量0.1mol/L的NaOH溶解；26不同植物的最适pH值种类最适pH值种类最适pH值杜鹃4.0月季5.8越桔4.5胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆5.5桃7.0番茄5.727预备阶段（2）•选择合适的外植体外植体大小要适宜；外植体的部位影响其分化能力和器官分化的类型；外植体的年龄影响其分化率；同一植物不同部位的分化需不同的生长素/激动素比例；不同物种的相同部位外植体分化能力不一样；28预备阶段（3）•除菌自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗外植体无菌滤纸吸干切割无菌外植体若干块无菌外植体置培养基上29常用消毒剂的使用和效果消毒剂使用浓度/%清除消毒时间/min灭菌效果次氯酸钠2容易5~30很好次氯酸钙9~10容易5~30很好漂白粉饱和溶液容易5~30很好升汞0.1~1较难2~10最好酒精70~75容易0.2~2好过氧化氢10~12最容易5~15好溴水1~2容易2~10很好硝酸银1较难5~30好抗生素4~50mg/L中等30~60较好30植物不同器官的消毒和处理•种子纯酒精浸10min，无菌水洗净，次氯酸钙（10％）浸20～30min，无菌水洗3～5次，无菌滤纸吸干；；•果实纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（2％）浸10min，无菌水反复冲洗，剥除种子和内部组织；•茎切段自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（2％）浸15～20min，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干；•叶片自来水洗净，纯酒精漂洗，升汞（0.1％）浸1min，或次氯酸钠（2％）浸15～20min，无菌水反复冲洗，无菌滤纸吸干；31诱导去分化形成愈伤组织添加较高浓度的生长素；固体培养；液体培养；光照培养；黑暗培养；32形成愈伤组织所需的激素•只需生长素类激素，如菊芋的块茎；•只需细胞分裂素激素，如芜菁根；•需上述两类激素，但有不同比例，多数植物；•还需复杂的天然提取物（椰子乳）等；33生长素类激素•吲哚乙酸（IAA）,常用1～10mg/L;•吲哚丁酸（IBA）,常用1～5mg/L；•2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-5～10-7mol/L;•萘乙酸（NAA），常用1.0mg/L；34细胞分裂素类激素•激动素（KT）•6-苄氨基嘌呤（6-BA）•玉米素先加少量碱液预溶35继代增殖阶段•移植扩增；•分割继代；36光照培养室37生根长芽阶段•生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用；•外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同；38长芽生根阶段39移栽成活阶段•保湿是关键；•避免强光直射；•温度适宜；40植物组培的优缺点•优点：ABCD•缺点：ABC41手指玫瑰42第二节植物细胞培养和次生代谢物生产•本方法的历史、现状1956年，Routier&Nickell首先提出把植物细胞当作工业合成天然产物的途径；1968年，Reinhard,Corduan&Volks经培养生产出“哈尔碱”（harmine);1972年，Furuya&Ishii经培养生产出“维斯纳精”（Visnagin);1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”；1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”，达到60mg/L；目前世界最大的细胞培养罐达20t；43红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物44细胞培养和原植物的天然产物量的比较产量物种天然产物细胞培养原植物橘叶鸡眼藤蒽醌900微克/克干重110微克/克干重决明蒽醌鲜重的0.334%种子干重的0.21%长春花蛇根碱干重的1.3%干重的0.26%三角叶薯蓣薯蓣皂苷26mg/克干重20mg/克干块根人参人参皂角苷鲜重的0.38%鲜重的0.3~3.3%烟草烟碱干重的3.4%干重的2~5%烟草泛醌0.5mg/克干重16mg/克干叶大红罂粟蒂巴因130mg/克干重140mg/克干叶45从植物培养细胞中获得的各类物质氨基酸核酸蛋白质碳水化合物脂类维生素有机酸抗白血病药抗肿瘤药抗病毒药抗微生物药酶抑制剂色素香料甜味剂鸦片杀虫剂激素强心苷核苷酸橡胶阿司匹林奎宁可卡因第二节植物细胞培养和次生代谢物生产46培养植物细胞制造疫苗•2006年2月，美国DowAgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗；•将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗，以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。47第二节植物细胞培养和次生代谢物生产•悬浮培养1.成批培养（封闭式培养）优点：易于操作；次生代谢物含量高；缺点：效率低；2.半连续和连续培养48第二节植物细胞培养和次生代谢物生产•固定化细胞培养次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性；细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质和各种物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于回收次生代谢物；49第二节植物细胞培养和次生代谢物生产•平床培养系统优点：制作简单；能生产较多次生代谢物；缺点：占地面积大；分化区比例较小；02供应受限；50包埋法固定细胞将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又分为凝胶包埋法和微胶囊法。⑴凝胶包埋法固定化