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测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。测序反应产生的荧光信号由放置在PTP板另一侧的CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果。由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来确定被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，导致荧光淬灭，从而使反应体系再生.