肿瘤细胞与分化、凋亡(三)

细胞凋亡的生物学意义1胚胎发育和形态发生2细胞稳态和免疫机制3衰老4肿瘤发生及化学治疗细胞凋亡和恶性肿瘤•1Bcl－2和恶性肿瘤•2P53和恶性肿瘤•3Bcr-abl和恶性肿瘤•4PML-RARα蛋白和恶性肿瘤细胞凋亡干预和肿瘤治疗•1野生型P53基因介导的肿瘤治疗•2Bcl－2基因介导的肿瘤治疗•3泛素－蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗•4三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗•5DADS诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡的检测方法1台肦蓝（trypanblue)染色法原理：trypanblue是一种细胞膜非通透性染料。坏死细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色。因此，该法能区分细胞的生存状态，简单、便捷、常规用于细胞死亡的初步评价和细胞存活率评价。注意事项：该法不能区别继发性坏死和真正意义上的坏死细胞；也容易低估细胞死亡程度。（因为早期凋亡细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞）2.丫啶橙染色（acridineorange,AO)和溴化乙啶(ethidiumbromide,EB)双染法原理：AO和EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色和橙色荧光。其中，AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞。因此，AO/EB双染法能借助荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死或继发性坏死细胞。注意事项：应用单一形态学计数凋亡细胞数（凋亡指数，apoptosisindex)常受到主观因素的干扰，其个体间甚至同一主体的重复性较差。荧光显微镜观察图9A未处理的HL-60细胞图9BDADS处理的HL-60细胞吖啶橙×40吖啶橙×403电子显微镜观察法电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特点，如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失、染色质固缩和线粒体超浓缩等，但由于样本制备复杂、耗时，该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测。3透射电镜观察图8A未处理的HL-60细胞图8BDADS处理的HL-60细胞透射电镜×6000透射电镜×60004DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳“梯形条带”图谱法原理：凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为200-300kb和30-50kb的片断（“结构域式”剪切），再进一步降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体片断（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在琼脂糖凝胶电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性“梯子”样外观。注意事项：梯状DNA(DNAladder)现象常被看作是细胞凋亡的重要生物化学标志。但是，日益增多的资料显示并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子样外观。因此，缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在。据报道，某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双链DNA降解，故不能形成“DNAladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈现典型“DNAladder”。故有DNAladder可以肯定凋亡存在，没有DNAladder不能排除凋亡的存在。图5不同浓度DADS作用HL-60细胞24h后DNA梯状条带的形成图660μmol·L-1DADS作用HL-60细胞不同时间后DNA梯状条带的形成５.TUNEL法（末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法）原理：DNA聚合酶能够填补双链DNA中的单链缺失部分，应用放射性同位素、生物素和荧光素等标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。TUNEL法是在含标记dUTP的反应体系中，加以末端DNA转移酶。故又称为TdT(terminaldeoxy-transferase)法。该法是应用无需模板的DNA聚合酶，延伸核苷酸的碱基序列与DNA底物无关。注意事项：该法只能了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量，虽然在理论上对这种方法的特异性尚有争议，但操作简便，并且可大量应用于回顾性研究，从而成为目前较为流行的细胞凋亡评价方法。TUNEL检测结果图10A未处理的HL-60细胞图10BDADS处理的HL-60细胞TUNEL×20TUNEL×206PI染色流式细胞术测定凋亡率原理：实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分子量DNA外漏，导致细胞内DNA含量减少。因此，应用DNA特异荧光染料（如碘化丙啶，propidiumiodide,PI）染色后，在FCM进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常以亚二聚体形式出现。亚二倍体细胞群被称为亚G1期（sub-G1)细胞。它的出现被认为是凋亡细胞的重要标志。注意事项：识别亚G1期细胞的同时，必须将它和细胞碎片区分开来，因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞。2.3流式细胞仪检测凋亡率control5mg·L-1DADS7.5mg·L-1DADS10mg·L-1DADS15mg·L-1DADS20mg·L-1DADS10mg·L-1DADS+PD10mg·L-1DADS+SB图7PI/AnnexinV双染色检测DADS作用HL-60细胞12h后凋亡率的变化3.3流式细胞仪检测凋亡率Fig15EffectsofSB205980andPD98059onDADS-inducedapoptosisinHL-60cells05101520253035untreatedPDSBDADS5DADS10DADS10+PDDADS10+SBapoptoticcells(%)图12PI/Anexin-V双染色流式细胞仪检测DADS作用K562细胞12h后凋亡率的改变EFGH图13流式细胞仪检测DADS作用K562细胞24h、48h后的凋亡率改变细胞凋亡死亡受体相关信号途径细胞凋亡死亡受体相关信号途径表3caspase家族主要成员序号原名功能底物特异性Caspase-1ICE辅助炎症WEHDCaspase-2ICH-1凋亡反应DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反应DEXDCaspase-4ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2辅助促炎症WEHDCaspase-5ICErel-Ⅲ,TY辅助促炎症WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反应(I/L/V)EXDCaspase-7Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反应DEXDCaspase-8FLICE,MACH,Mch-5凋亡反应(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6.Mch6凋亡反应(I/L/V)EXDCaspase-10Mch4凋亡反应Caspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICHCaspase-14MICE(Mini-ICE)Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHHL-60Time(h)0124824图30DADS作用HL-60细胞后caspase3的表达变化Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHK562Time(h)0124824图31DADS作用K562细胞后caspase3的表达变化Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHRajiTime(h)0124824图32DADS作用Raji细胞后caspase3的表达变化细胞凋亡线粒体相关信号途径MMP开放线粒体外膜PBRCyclophilinDANTPorin△φm下降AIFCytoC/Apaf-1/procaspase-9caspase-9-caspase-8caspase-3apoptosisBaxMitoTrackeroverlay图34激光共聚焦检测HL-60细胞中Bax的线粒体转位overlayMitoTrackerBax图35激光共聚焦检测K562细胞中Bax的线粒体转位•DADS通过启动Mcl-1/Bid/Bax/Caspase-9/Caspase-3线粒体凋亡通路诱导HL-60和K562细胞凋亡。MMP开放和caspase活化的“正反馈”环MMP开放Caspase-3活化线粒体膜屏障功能破坏线粒体肿胀CyotoC释放Apoptosome（procaspase-9/Apaf-1/CytoC）Caspase-9活化膜间蛋白（如AIF）释放刺激ceremide酶活化剪切MMP复合物凋亡诱导剂结合Apaf-1和procaspase-9内源性细胞凋亡抑制物•1Caspase－8（FLICE)抑制蛋白（FLIP)•2SODD(silencerofdeathdomain)•3IAP（inhibitorofapoptosisprotein)•4Survivin•5Bcl-2家族蛋白Bcl－2家族蛋白的结构和功能Bcl－2的两大结构域：TMBHBcl－2家族蛋白活性调节Bcl－2家族蛋白的效应机制MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHHL-60Time(h)0124824图24DADS处理HL-60细胞后Bcl-2家族成员的表达变化GAPDHBakBaxBcl-2K562BidTime(h)0124824图25DADS作用K562细胞后Bcl-2家族成员的表达变化MCL1Time(h)0124824MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHRaji图26DADS作用Raji细胞后Bcl-2家族成员的表达变化QuantitationdataforCyclingB.FAM/SybrStandardCurve图27DADS作用HL-60、K562、Raji细胞后MCL1mRNA表达水平的变化QuantitationdataforCyclingB.FAM/SybrStandardCurve图28DADS作用HL-60、K562、Raji细胞后BaxmRNA表达水平的变化StandardCurveQuantitationdataforCyclingB.FAM/Sybr图29DADS作用HL-60、K562、Raji细胞后BidmRNA表达水平的变化总结诱导恶性肿瘤细胞分化与凋亡是当前肿瘤研究领域中的热门课题，各种防癌抗癌药物及分化与凋亡诱导剂的出现，为肿瘤的治疗提供了可选择的机会。对恶性肿瘤的分化与凋亡调控机理的研究，可以深入地认识肿瘤发生发展的调控途径，分析恶性肿瘤差异性表达的基因与蛋白，为恶性肿瘤的靶向治疗提供理论依据，这是人类肿瘤治疗的美好蓝图。