限制性内切酶原理

限制酶的定义1限制酶的种类2Ⅱ型限制酶的应用3II型限制酶DNA甲基化酶4限制酶的定义1限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoRI和EcoRII，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）的HindII和HindIII。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。限制酶的发现命名EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号切割频率切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4。如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6bp，则其切割频率为(1/4)6=1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个bp，则其切割频率为（1/4）n。限制酶的种类2I型限制酶通常其切割位点与识别位点相距千个碱基,不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。II型限制酶所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。III型限制酶切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。什么是回文序列？GAATTAAGCTTAATTCGAATATTCCTTATAAGII型限制酶ApaI识别序列：5'GGGCC^C3'BamHI识别序列：5'G^GATCC3'BglII识别序列：5'A^GATCT3'EcoRI识别序列：5'G^AATTC3'HindIII识别序列：5'A^AGCTT3'KpnI识别序列：5'GGTAC^C3'NcoI识别序列：5'C^CATGG3'NdeI识别序列：5'CA^TATG3'NheI识别序列：5'G^CTAGC3'NotI识别序列：5'GC^GGCCGC3'SacI识别序列：5'GAGCT^C3'SalI识别序列：5'G^TCGAC3'SphI识别序列：5'GCATG^C3'XbaI识别序列：5'T^CTAGA3'XhoI识别序列：5'C^TCGAG3'II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。粘性末端和平末端5’NNNGTTAACNNN3‘3’NNNCAATTGNNN5‘5’NNNGTTAACNNN3’3‘NNNCAATTGNNN5’5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘HaeⅠ的识别序列NotⅠ的识别序列5’粘性末端和3’粘性末端5’NNGCGGCCGCNN3‘3’NNCGCCGGCGNN5‘5’NNNGC-OHP-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-PHO-CGNNN5‘5’粘性末端3’粘性末端5’NNGGTACCNN3‘3’NNCCATGGNN5‘5’NNGGTAC-OHP-CNN3‘3’NNC-PHO-CATGGNN5‘同尾酶切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡ同裂酶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。例如：HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但XmaI的切点在C^CCGGG，形成带有CCGG的粘性末端；而SmaI的切点则在CCC^GGG，形成平末端。有些限制酶识别的序列不是回文序列。AccⅠ的识别切割位点分别是GTAGAC和GTCTACBbvCⅠ的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG特殊的II型限制酶GT↓ATCGACCATAGC↑TGCC↓TCAGCGGAGT↑CG1)DNA的纯度2)DNA的甲基化程度3)酶切消化反应的温度4)DNA的分子结构5)限制性核酸内切酶的缓冲液6)Star活性（星活性）影响限制性酶活性的因素限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用三种方法：①增加限制酶的用量。②扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑制因素被相应地稀释）③延长酶催化反应的保温时间。DNA的纯度DNA的甲基化程度识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会严重影响酶的催化效率。为避免这样的问题，在基因克隆中使用的质粒DNA是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提取的。酶切消化反应的温度不同的限制酶具有不同的最适反应温度。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是37℃，有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃。DNA的分子结构DNA分子的不同构型对限制酶的催化效率也有很大的影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。核酸内切限制酶的缓冲液II型限制酶的最适pH一般是6-8,缓冲液中通常含有Mg2+。Star活性（星活性）限制酶在一些特定条件下使用时，识别位点的特异性降低，可以把不同于正常识别的序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同。Star活性主要受低粒子强度、高pH值以及过高的甘油浓度的影响。消化DNA样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。方法：1）65℃温浴5-10分钟，使酶失活。2）加入EDTA除去酶分子的镁离子，是使酶失活。3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。4）用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。限制性内切酶反应的终止限制性内切酶的保存限制酶于-20℃用50％的甘油保存。基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。Ⅱ型限制酶在基因工程中的的应用3将目的基因导入受体细胞前，需要用相同的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。•••NNAAGCTTNN•••NNGGATCCNNN••••••NNTTCGAANN•••NNCCTAGGNNN•••HindIIIBamHIHindIIIBamHI双酶切法AGCTTNN•••NNGANN•••NNCCTAG为什么通常要用两种限制酶？可以有效防止载体自连造成空载体。HindIIIBamHI连接酶可不可以用一种酶切割目的基因和载体？可以，此时切割后的载体需要加入碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶可以去除酶切后切口的磷酸，从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGC-OHp-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-pHO-CGNNN5‘5’NNNGC-OHGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGHO-CGNNN5‘碱性磷酸酯酶单酶切法pAGCTTNN•••NNA-OHHO-ANN•••NNTTCGApDNA连接酶基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么办？Hsp70A：Ex-F5'CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG3'NdeIHsp70A：Ex-R5'GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3'NotI通常是设计合适的PCR引物，让目的基因在PCR扩增后，两侧含有酶切位点。DNA甲基化酶4甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。Dam甲基化酶在GATC序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ等）的识别位点中含GATC序列。有些限制酶对Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列，如BclⅠ。有些限制酶对Dam甲基化的DNA不敏感，如BamHⅠ、Sau3AⅠ等。甲基化酶对限制酶的影响：1.修饰酶切位点。构建DNA文库时，用AluⅠ（AG↓CT）和HaeⅢ（GG↓CC）部分消化基因组DNA后，将得到的片段用M.EcoRⅠ甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRⅠ接头，再用EcoRⅠ来切割时只有接头上的位点可被切割，从而保护基因组片段。2.产生新的酶切位点有些酶只识别经过甲基化的序列。DpnⅠ是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA受M.TaqⅠ处理后形成甲基化(A)产物TCG*ATCG*A，其中G*ATC即为DpnⅠ位点。