抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查

第七节抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查•抗微生物药物敏感性试验（antimicrobialsusceptibilitytet，AST）是对敏感性不能预测的临床分离菌株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物和了解区域或医院内常见病原菌耐药性变迁，有助于临床经验性治疗选药。药敏试验用药的选择•药敏试验用药需综合考虑下列因素：①根据本地致病菌的流行病学和耐药性调查结果，分析感染常见菌以及它们的耐药模式，选取对当地流行株敏感的抗菌药物；②不选择细菌所具固有耐药的抗菌药物如革兰阴性杆菌对万古霉素固有耐药，革兰阳性球菌对氨曲南固有耐药；③优先选用高效低毒的抗菌药物；④选用价格便宜、供应充足的抗菌药物。ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI)（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards，NCCLS）•经常更新和发布临床微生物实验室常规药敏试验的药物选择和报告指南，•可供我们参考。该指南将抗菌药物分成A、B、C、U四组（表8-11、12）：•（1）A组：为常规药敏试验的首选药物，其结果也应常规报告。•（2）B组：包含一些临床上重要的特别针对医院感染的药物，亦可作为首选药物，但只是选择性地报告给临床，当细菌对A组同类药物耐药、特定的标本来源、多种细菌感染、多部位感染等情况也应报告B组药物的敏感结果。对A组药过敏、耐受或无效的病例和以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。•（3）C组：为一些替代性或补充性的抗菌药物，可在以下情况选择并进行试验：医院内潜在有对数种基本药物耐药（特别是耐同一类药物，如β-内酰胺类或氨基苷类）的菌株的局部流行或广泛流行；治疗对基本药物过敏的患者；治疗特定致病菌的感染（如选择氯霉素用于肠道外分离的沙门菌属的感染和耐万古霉素的肠球菌的感染）和以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。•（4）U组：仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物）和针对一些特定的泌尿道致病菌（如铜绿假单胞菌）的抗菌药物。抗菌素抑菌杀菌作用常用敏感性试验的方法•预测治疗效果的试验：•1、稀释法（minimalinhibitoryconcentration，MIC）•2、K-B纸片琼脂扩散法(Kirby-Barerdiscagardiffusionmethod)•3、E试验（Epsilometertest）•4、最低杀菌浓度测定（minimalbactericidalconcentration，MBC）•5、联合药敏试验（testofantibioticcombination）左起第四管为药物最低浓度而肉眼无细菌生长，即待测菌的MIC为16mg/L•K-B法试验程序比浊涂布平板上放置药敏纸片量取抑菌圈大小挑取菌落转种肉汤•E试验法1、常见菌2、苛氧菌3、厌氧菌4、酵母菌5、真菌•联合药物敏感试验意义•联合抑菌试验•最低杀菌浓度测定常用敏感性试验的方法•监控治疗效果试验：•1、血清抗菌药物浓度测定（serumantimicrobiallevel）•2、血清抗菌活性测定（serumantimicrobialavtivity）产生细菌耐药性的主要原因抗菌药物的滥用，导致对细菌产生巨大的选择压力（selectivepressure），使那些原来只占极小比例的耐药菌（10-6~10-9，自发突变频率），迅速繁殖。动物很可能是一个蓄积耐药细菌，并向人体传递耐药细菌的储蓄库。细菌耐药性的生物化学机制•灭活酶和钝化酶的产生1.β-内酰胺酶水解药物β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性。2.氨基糖苷类钝化酶有3类：乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(AAD)，分别通过乙酰化作用、磷酸化作用、核苷化作用灭活此类抗生素。3.氯霉素乙酰转移酶4.红霉素酯酶和其他灭活酶细菌耐药性的生物化学机制•抗菌药物渗透障碍对革兰阴性菌而言，外膜的通透性对药物进出菌体至关重要。亲水性的药物通道蛋白为OmpF、OmpC和PhoE。抗生素可以直接扩散进入膜内并到达菌体内相应作用部位。疏水性越强的抗生素、带负电荷越多的抗生素分子、较大的药物分子也不易通过。外膜蛋白的缺失可导致细菌耐药性的发生。细菌的外膜上特殊的药物泵出系统使菌体内的药物浓度不足导致耐药。铜绿假单胞菌外膜上有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素，是产生耐药的重要机制。细菌耐药性的生物化学机制•药物作用靶位的改变通过靶位的改变使抗生素不易结合，是耐药发生的重要机制。1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺类抗生素耐药。2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉素类抗生素耐药。3.DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药的重要机制。细菌耐药性的生物化学机制•药物作用靶位的改变4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变对磺胺-甲氧嘧啶耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。5.PBP发生改变,β-内酰胺类抗生素不能结合或亲和力降低，则产生耐药，如金黄色葡萄球菌中PBP转变为PBP2a。大肠埃希菌中PBP3改变，引起对头孢氨苄和其他头孢抗生素耐药。6.肠球菌van基因编码产生肽聚糖上一种前体蛋白，阻碍万古霉素和肽链间相互作用而导致耐药。细菌耐药性的生物化学机制细菌耐药性检测方法•一、细菌耐药表型检测•二、β-内酰胺酶检测–碘淀粉测定法（iodometrictest）–头孢色原菌素纸片法（nitrocefintest）•三、耐药基因检测药物监测的特殊试验•1、β-内酰胺酶检测•2、超广谱β-内酰胺酶检测•3、琼脂筛选试验•4、耐药基因检测临床耐药流行菌株的检测•耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）检测•耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）检测•耐万古霉素肠球菌（VRE）检测•超广谱β-内酰胺酶检测肠杆菌科细菌检测苯唑西林-盐平板法筛选MRSA菌株纸条扩散法筛选MRSA菌株一、肺炎链球菌•值得注意的是耐青霉素的肺炎链球菌(penicillinresistantstreptococouspneomonia，PRSP)。PRSP占肺炎链球菌13.8%，对策阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢噻肟、头孢呋辛、氧氟沙星、万古霉素的敏感率为95.6%～100%，85.1%的PRSP株对头孢曲松敏感。而红霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑的耐药率高达62.9%～77.4%。三、金黄色葡萄球菌•近年来由于抗生素的广泛应用，耐药菌株迅速增多，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantS.aureus，MRSA）已成为医院感染最常见的致病菌。细菌药敏试验常规首选抗生素为苯唑西林和青霉素；通过药敏试验可筛选出耐甲氧西林葡萄球菌(methecillinresmtantStaphylococcus，MRS)，该菌株耐所有青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和β-内酰胺药、β-内酰胺酶抑制剂类抗生素，同时对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类抗生素也耐药。四、铜绿假单胞菌•铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认为是由于该菌具有外膜的低通透性（主要是外膜微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质），最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多采用联合治疗，如选用一种β内酰胺类抗生素与一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。八、肠杆菌科•肺炎克雷伯菌的耐药性主要表现在产生超广谱-内酰胺酶（ESBL）。产ESBL细菌对青霉素类、第1、2、3代头孢菌素及单环菌素耐药，仅对头霉素类、碳青霉烯类及酶抑制剂（克拉维酸）敏感。ESBL检测现已作为医院细菌室常规检测项目。