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第五章核酸类药物第一节概述核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。98%分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体。主要分布于细胞质（90%），剩余10%位于细胞核。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。核酸碱基戊糖核苷磷酸核苷酸核酸类药物是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。除了天然存在的碱基、核苷、核苷酸外，它们的类似物、衍生物或这些类似物、衍生物的聚合物也属于核酸药物。一、RNA的制备（一）材料的选择与预处理制备RNA的材料要选择含核酸量丰富的组织。RNA的含量和细胞的活跃程度有关，在蛋白质合成旺盛的细胞中，其核酸的含量也相应地较高。第二节核酸类药物的一般制备方法组织匀浆沉淀物（DNA、蛋白质等）上清液（RNA等）残留物（DNA等）酸提取液（RNA）碱处理酸处理残留物脂溶性物质有机溶剂处理残留物酸溶性小分子冷酸处理1.酸处理法将经酸和有机溶剂处理后的残留物用1mol/L的过氯酸液于4℃下处理18h，从中抽提出RNA，沉淀部分再用0.5mol/L的过氯酸液70℃下处理20min提取DNA。此法的缺点是有些材料的DNA在冷过氯酸抽提时被少量提取，从而使RNA部分中混有少量的DNA。2.碱处理法将残留物用1mol/L的NaOH溶液于37℃处理过夜，则RNA被碱解为碱溶性核苷酸，DNA不溶解。加入过氯酸或三氯乙酸使溶液酸化，至酸浓度为5%-10%,此时，RNA的分解产物溶解在上清液中，DNA等则被沉淀下来。此法的优点是RNA和DNA分开得较为彻底，缺点是RNA中还含有其他含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。（二）提取与纯化1.提取（1）乙醇沉淀法（2）去污剂处理法（3）酚法2.纯化（1）密度梯度离心法（2）柱色谱法（3）凝胶电泳法（三）含量测定1.定磷法（1）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；（2）制定定磷标准曲线；（3）测定回收率和样品总磷量。(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2OH3P(Mo3O10)4Mo2O3•MoO3（钼蓝）2.定糖法Vit•CRNA中的戊核糖可在盐酸的水解作用下游离出来，进一步形成糠醛，然后与地衣酚反应，反应物程鲜绿色，在670nm有最大吸收峰。二、DNA的制备1.材料的选择与处理2.提取与纯化3.含量测定（1）定磷法同RNA（2）定糖法又称二苯胺法，在酸性溶液中，将DNA与二苯胺共热，形成蓝色化合物，该化合物在595nm有最大吸收。当DNA浓度在20-200ug/mL时，光吸收度与DNA浓度呈正比。三、核苷酸、核苷及碱基的制备（一）制备方法1.直接提取法2.水解法（1）酶水解法（2）碱水解法（3）酸水解法3.化学合成法4.酶合成法5.微生物发酵法光合磷酸化法制备ATP的工艺流程5′-AMP[溶解，混合]Na2HPO4，Tris，PMS肌激酶，ATP（引子）混合液反应液ATP粗制品上清液滤液ATP成品ATP沉淀洗脱液（含ATP）吸附物流出液[光合]叶绿体pH3,1-1.5h[沉淀]三氯乙酸10℃以下[提取]乙醇10℃4-5h[干燥]乙醇，乙醚减压[去阳离子]732树脂pH6→1→2[除热源、沉淀]硅藻土、乙醇[去杂质]蒸馏水、硅藻土[洗脱]NaCl溶液pH3.8[吸附]NaOH，717树脂pH6.5-7ATP的药理作用与临床应用在生物体内，ATP广泛参与各种生化过程，除参与核酸形成外，主要起着供应能量和磷酸基团的作用。ATP除了作为危重病人抢救的辅助药物外，还可对慢性肝炎、肝硬化、肾炎、心肌炎、冠状动脉硬化、进行性肌肉萎缩、再生障碍性贫血、脑血管意外后遗症、中心性血管痉挛性视网膜脉络膜炎、风湿性关节炎、耳聋、耳鸣等有一定疗效。第五章酶类药物第一节概述一、酶类药物发展简史酶类药物是直接用各种剂型的酶以改变体内酶活力，或改变体内某性质生物活性物质和代谢产物的数量等，从而达到治疗某些疾病的目的。1926年，Sumner将尿素酶结晶是药用酶工业化的起点。1952年，Innerfield首次将结晶的胰蛋白酶用于治疗血栓性静脉炎，真正揭开了酶在医疗应用的序幕。20世纪60年代后期，逐渐发展到从微生物发酵液中获得大量的酶。70年代后，开始利用人的某些组织细胞培养技术和基因工程手段来获取有关的酶，使酶类药物的应用得到了迅速发展。对酶类药物的要求1.药用酶应在生理环境（pH中性）下具有最高活力和稳定性。2.对其作用的底物具有较高的亲和力。3.在血清中半衰期较长。4.要求纯度高，特别是对注射用的酶类药物纯度要求更高。5.酶应免疫源性较低或无免疫源性。二、酶的分子组成及分类1.酶分子的组成①单体酶②寡聚酶③多酶复合体酶有机物分子金属有机物金属辅酶或辅基（非蛋白部分）酶蛋白复合蛋白质单纯蛋白质（单体酶）2.酶的分类分类名称催化反应的类型实例1氧化还原酶电子转移醇脱氢酶2转移酶转移功能基团己糖激酶3水解酶水解反应胰蛋白酶4裂合酶键的断裂丙酮脱羧酶5异构酶分子内基团的转移顺丁烯二酸异构酶6连接酶或合成酶键形成与水解偶联丙酮羧化酶表6-1酶的国际分类三、酶类药物的临床应用1.消化酶类2.抗炎、黏痰溶解酶3.与纤维蛋白溶解作用有关的酶类4.抗肿瘤的酶类5.其它生理活性酶6.复合酶表6-2酶类药物一览表第二节酶类药物的一般制备方法酶制备过程的特点：一是某种酶在生物体内含量甚少，且有分布部位特异性。二是酶可以通过测定其活力加以跟踪。酶制备一般包括四个步骤：酶的原材料的选择与处理；酶的提取；酶的纯化；酶活力的测定和纯度检测。一、酶的原材料选择与预处理（一）原材料的选择（1）了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的生物材料。（2）考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的差别及杂质干扰的情况。（3）原料来源是否丰富，原料易得，原料产地较近。（4）提取步骤是否简便易行。用植物组织作原料，要择时采集并就地去除不用部分，将有用部分保鲜处理。（二）原材料的预处理1.机械法2.反复冻融法3.超声波法4.酶解法5.丙酮粉法二、酶的提取1.水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。水溶液的pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：①酶的稳定性②酶的溶解性③酶与其他物质结合的性质选择pH的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当的pH。2.有机溶剂法某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是丁醇。丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能起表面活性剂的桥梁作用。丁醇提取方法：均相法和两相法3.表面活性剂法三、酶的纯化不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。（一）杂质的除去1.调pH和加热沉淀法（核糖核酸酶，溶菌酶的提取）2.蛋白质表面变性法（CAT用氯仿提取）3.选择性变性法（细胞色素C可用三氯醋酸提取）4.降解或沉淀核苷酸法5.利用结合底物保护法除去杂蛋白（D-甲基苯甲酸为D-氨基酸氧化酶的保护剂）（二）脱盐和浓缩1.脱盐（1）透析（2）凝胶过滤2.浓缩（1）蒸发（2）超滤法（3）凝胶吸水法（4）冷冻干燥法（三）酶的结晶1.盐析法2.有机溶剂法3.透析平衡法4.等电点法四、酶活力的测定与纯度检验1.活力测定无论在酶的抽提纯化过程中或是对酶的性质进行研究过程中为了了解所选择方法是否适宜，几乎每一步骤前后都应进行酶的活力测定，做出总活力和比活力的比较。2.纯度检测在酶的分离提纯中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的回收率（Y），而比活力则用于计算某一纯化步骤的效果，即纯度的提高（E），其关系如下：Y=某步骤后的总活力/某步骤前的总活力E=某步骤后的比活力/某步骤前的比活力五、菠萝蛋白酶是从菠萝汁或加工菠萝削下的废皮中提取的一种蛋白水解酶，粗菠萝水解酶是各种成分的混合物，除蛋白水解酶系外，还含有磷酸酯酶、过氧化物酶、纤维素酶、其它糖苷酶及非蛋白物质。实验证明，菠萝蛋白酶具有消炎抗水肿作用，作用特点是能选择性水解纤维蛋白，对与凝血有关的纤维蛋白原仅有微弱的作用，不影响正常血液的凝固。能分解肌纤维，可单独或与胰蛋白酶制成合剂使用，消除各种单纯性炎症、水肿、血肿，促进抗生素和化疗药物的渗透和扩散。临床适用于治疗支气管哮喘、急性肺炎、产后乳房充血、乳腺炎、产后血栓静脉炎、视网膜炎等。试用于同抗生素配伍治疗关节炎、关节周围炎、蜂窝组织炎和小腿溃疡等。（一）化学性质和组成白色至浅棕黄色无定形粉末。略溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚，为一种巯基酶。半胱氨酸能激活酶的活性，但受重金属抑制。最适pH7.0，相对分子量33000。主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。（二）生产工艺（白陶土吸附法）（吸附）白陶土10℃菠萝蛋白酶成品湿菠萝蛋白酶精制品澄清液粗制品（沉淀）HClpH4（溶解）自来水，NaOH洗脱液（盐析、抽滤）HCl，（NH4）2SO4pH=4.5～5吸附物（洗脱）Na2CO3或NaOH（NH4）2SO4pH=6.5～7压出液菠萝皮（压榨）苯甲酸钠（干燥、粉碎）pH7～7.5（三）检验方法1.性状富有菠萝香气，浅黄色或浅棕黄色粉末。2.蛋白酶水解活力测定（1）原理菠萝蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并沉淀除去未水解的蛋白，滤液对紫外光有吸收，用紫外分光光度计法测定，根据吸光度计算酶活力。（2）酶活力单位定义在测定条件下[pH7.0，（37+0.2℃）]，每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在275nm的吸光度与1µg酪氨酸的吸光度相当时，所需酶量为1U。（3）测定步骤①适当稀释样品后，精密量取样品待测液1mL，置于具塞试管中，于，37℃预温10min，迅速加入37℃预温的酪蛋白溶液5mL，从开始加入起准确反应10min，加入三氯乙酸溶液5mL，混匀，保温10min后过滤。②另量取1mL待测样品液于37℃预温10min，精密加入三氯乙酸溶液5mL，准确反应10min，加入酪蛋白溶液5mL，摇匀，保温10min后过滤，滤液作为上述溶液的空白对照。用分光光度计在275nm的波长处测吸光度A。③以水做空白对照，在275nm的波长处测定50µg/mL酪氨酸吸光度A。（四）菠萝蛋白酶在医药、保健品业的应用1、抑制肿瘤细胞的生长经相关临床研究观察表明，菠萝蛋白酶能抑制肿瘤细胞的生长。2、对心血管疾病的防治菠萝蛋白酶作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是有益的。它能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风,缓解心绞痛症状,缓和动脉收缩,加速纤维蛋白原的分解。3、用于烧伤脱痂菠萝蛋白酶能选择性地除皮,使新皮移植得以尽早进行。动物实验证明,菠萝蛋白酶对邻近的正常皮肤无不良影响。局部使用抗生素不影响菠萝蛋白酶的效果。4、消炎作用菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿(包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤)，菠萝蛋白酶具有激活炎症反应的潜力。菠萝蛋白酶还可治疗腹泻。5、增进药物吸收将菠萝蛋白酶与各种抗生素(如四环素,阿莫西林等)联用,能提高其疗效。相关研究表明,它能促进抗生素在感染部位的传输,从而减少抗生素的用药量。据推断,对于抗癌药物,也有类似的作用。此外，菠萝蛋白酶能促进营养物质的吸收。第七章多糖类药物第一节糖类药物概述按照含有糖基数目的不同分为:①单糖：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。②低聚糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖等。③多糖：（糖类药物研究的最多是多糖类药物）多糖如有旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。还有一些糖类药物是糖的衍生物，如6-磷酸葡萄糖，1，6-二磷酸果糖，磷酸肌醇等。多糖的药理作用（1）调节免疫功能主要表现为影响抗体活性