植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药性研究进展

第2卷　第4期2006年12月烟草农业科学TobaccoAgriculturalScienceVol.2　No.4Dec.　2006植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药性研究进展*祝明亮1，罗义勇2，李梅云1，杨金奎2，张克勤2（1.云南省烟草科学研究所，云南玉溪　653100；2.云南大学生物资源保护与利用重点实验室，云南昆明650091）摘要：植物病原真菌的抗药性特别是对内吸性杀菌剂的抗药性是植物病害化学防治中的一个非常严重的问题，它给多种农作物和经济作物的病害防治带来了严重困难，给国家和农民造成了大量经济损失。研究植物病原真菌抗药菌的生物学特征以及它们的抗药机制对于改进化学农药使用策略，延缓抗药性的产生，推进植物病害的化学防治，具有十分重要的理论和实践意义。本文综述了近年来国内外植物病原真菌对内吸性杀菌剂抗药性研究在抗性菌和敏感菌的生物学特征、内吸性杀菌剂对植物病原真菌的作用机制、植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药机制、抗性菌株的分子检测技术以及抗药性利用等方面的成果。关键词：植物病原真菌；内吸性杀菌剂；抗药性；抗药机制中图分类号:S481.4文献标识码:AResearchAdvancesinResistancetoIn-suckFungicidesofPhytopathogenicFungiZHUMing-liang1,LUOYi-yong2,LIMei-yun1,YANGJin-kui2,ZHANGKe-qin2（1.YunnanTobaccoResearchInstitute,Yuxi653100,China；2.LaboratoryforConversationandUtilizationofBio-ResourcesofYunnanUniversity,Kunming650091,China）Abstract:Theresistancetofungicideofphytopathogenicfungi,especiallyresistancetoin-suckfungicideisaveryseriousproblem,anditbringsgreatdifficultyinpreventingandcontrollingofdiseasesonmanyagriculturalandeconomiccrops,andcanleadtohugelossestothecountriesandthefarmers.Thestudyofthebiologicalcharacteristicsofresistantphytopathogenicfungihasgreattheoreticandpracticalsignificanceforimprovingthestrategyofchemicalpesticideapplication,postponingtheoccurrenceoftheresistanceandadvancingthechemicalpreventionandcontrolofdiseasescausedbyphytopathogenicfungi.Thispaperreviewedtheresearchadvancesintheresistancetoin-suckfungicide,includingthebiologicalcharacteristicsofresistantandsensitivephytopathogenicfungi,themechanismofin-suckfungicidetophytopathogenicfungi,theresistantmechanismofphytopathogenicfungitoin-suckfungi,moleculardetectiontechniquesoffungicideresistancetophytopathogenicfungiandtheapplicationoftheresistance-fungicideofphytopathogenicfungi.Keywords:Phytopathogenicfungi；In-suckfungicide；Fungicideresistance；Resistantmechanism收稿日期：2006–10–17；修回日期：2006–12–26基金项目：云南省烟草专卖局（公司）科技项目（04A19）作者简介：祝明亮，男，博士，助理研究员，从事烟草植保及微生物研究。﹡植物病原真菌对杀菌剂的抗药性是指本来对药剂敏感的植物病原真菌，由于基因突变或其它原因出现了药物敏感性下降的现象。尽管早在1954年JAMES等［1］就提出了这一现象，但是这一问题直到20世纪60年代末才引起人们真正重视。1969年，由于内吸性杀菌剂苯来特（Benomyl）在生产上大量地使用，首先在黄瓜白粉病菌（Sphaerothecafuliginea）上产生了抗药性，随后又在其它几十种病原真菌上产生了325第4期抗药性，并且有越来越严重的趋势。到目前为止，用于防治植物病原真菌的杀菌剂种类已经很多，与抗药性问题关系密切的有有机硫杀菌剂、内吸性杀菌剂和抗菌素类杀菌剂，特别是内吸性杀菌剂的抗药性问题最为严重。由于杀菌剂抗药性问题的迅速出现和发展，给植物病害的防治带来了越来越大的困难，给农业造成了重大的经济损失，引起了世界各国政府和农民的普遍关注。为了有效防止或延缓杀菌剂抗药性的产生，许多国家和地区相继开展了对杀菌剂的抗药性研究。人们首先对敏感菌和抗药菌的生物学特征进行了大量的对比研究，试图在此研究的基础上发现抗性病原真菌的抗药机制，最终来指导农药的合理使用和病菌的有效防治。经过大量研究人员的辛苦努力，在植物病原真菌对杀菌剂抗药性问题的研究上，尤其是对内吸性杀菌剂的研究上，目前已取得了较大的进展。1　抗性菌和敏感菌的生物学特征对比抗性菌生物学特征即抗性菌的越冬、越夏、生长、繁殖和对环境的适应力等方面的特征。许多情况下，抗性菌由于遗传变异等原因，在生物学特征上表现出与敏感菌有所不同，如在菌丝生长、产孢、与温度或渗透压的关系、致病力等方面的差异，这些差异影响着抗性菌在自然界与敏感菌的竞争力。当抗性菌的竞争力强时，比较容易形成抗药性群体；反之，只要降低选择压力，就不易形成抗药性群体。此外，有些抗性菌对同类或不同类的杀菌剂具有交互抗药性或负交互抗药性。因此，人们可以根据抗性菌的特点，判断合理的用药策略，延缓或阻止抗药性群体的形成。1.1　菌丝生长、产孢、孢外酶活力和致病力等方面的差异据研究报道，大多数抗药性病原真菌突变的适合度低于敏感菌。抗药性菌株表现出菌丝生长速率慢，产孢量和产孢密度低，孢子萌发能力弱且滞后，孢外酶活力低，致病力弱，甚至完全失去致病力等特征［2–3］。然而并不是所有的抗药性菌株的适合度都低于敏感菌，有些抗药性菌株具有很高的适合度，与野生敏感菌没有差异，甚至比敏感菌还高。纪明山等研究灰霉病菌（Botrytiscinerea）对多菌灵（Carbendazim）和乙霉威（Dithofencarb）抗药性时，发现抗药菌与敏感菌在生长速率、产孢能力及致病力等方面无显著差异［4］。徐作珽等报道蔬菜灰霉病菌对速克灵（Procymidone）的抗性突变体表现出较强的适应性，能正常生长繁殖产孢和侵染致病，且生存竞争能力较敏感菌强［5］。我们在CA平板上测定烟草黑胫病菌对甲霜灵高抗、低抗和敏感菌株生长速率时发现，高抗菌株的生长速率较低抗和敏感菌株更快，而且高抗菌株仍然保持了较高水平的致病力。1.2　交互抗药性与负交互抗药性交互抗药性是指植物病原真菌对一种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过但作用机制相似的药剂也产生了抗药性的现象。与交互抗药性相反，负交互抗药性是指植物病原真菌对某种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过的药剂敏感性更强的现象。交互抗药性和负交互抗药性在同类或不同类的杀菌剂之间普遍存在［6–7］。1.3　多效性多效性是指抗药菌的抗性基因可以同时引起其它的性状，如对低温、高温或渗透压的敏感性。THOMAS等在研究酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）对苯来特的抗药性时，发现在173个抗性菌株中，有6个菌株对低温敏感，3个菌株对生长温度敏感［8］。在研究植物病原真菌对二甲酰亚胺类杀菌剂（Dicarboximidesfungicide，DCFs）的抗药性时，粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）os–1型渗透压突变菌表现出对DCFs的抗药性［9］。2　内吸性杀菌剂的作用机制与植物病原真菌的抗药机制内吸性杀菌剂是指能在植物发病后，通过内吸或渗透作用进入植物体内，抑制或杀死病原菌，使病株不再受害、恢复健康的药剂，主要有以下几类：苯并咪唑类（Benzimidazoles），二甲酰亚胺类，有机磷类（Organophosphates），苯酰胺类（Phenylamides），甾醇生物合成抑制剂类（SterolBiosynthesisInhibitors，SBIs）和甲氧基丙烯酸酯类（Strobilurins）（表1）。2.1　苯并咪唑类苯并咪唑类杀菌剂是最早也是最成功的内吸性杀菌剂，由于该类杀菌剂大量和长期的使用，病原真菌对它的抗药性问题越来越严重。在真菌对杀菌剂抗药机制的研究中，真菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药机制的研究最系统、最深入。该类杀菌剂的杀菌机制为：首先结合构成纺缍丝的微管蛋白，使微管的形成受阻，从而破坏纺缍丝的功能，阻碍细胞的正常有丝分裂，使菌株不能正常的生长。研究表明，不同病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性的主要机制是病原真菌的β–微管蛋白与该类杀菌剂的结合力下降，而杀菌剂同微管蛋白的亲和性的改变又与β–微管蛋白的结构变化有关。分子生物学研究表明，在抗药菌β–微管祝明亮，等：植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药性研究进展烟草农业科学326第2卷表1　内吸性杀菌剂的种类、杀菌机制及病原菌抗药机制Tab.1　Actionmechanismofin–suckfungicideandresistancemechanismofphytopathogenicfungi种类代表性药剂杀菌机制病原菌抗药机制苯并咪唑类多菌灵、苯来特、特克多和甲基托布津结合病菌的β–微管蛋白，阻碍细胞的正常有丝分裂β–微管蛋白的192–202个氨基酸发生基因突变二甲酰亚胺类乙烯菌核利、速克灵、菌核净和扑海因自由基介导的细胞毒假说双组分组氨酸蛋白激酶N端的6个90氨基酸重复区发生突变有机磷类磷酰胺类：定菌磷抑制真菌对氧分子的吸收不常见硫代磷酸酯类：稻瘟净、异稻瘟净和克瘟散破坏菌体生物膜的结构①裂解药剂“S–C”键以致失去生物活性；②可能与药剂靶点修饰或细胞膜透性改变有关苯酰胺类甲霜灵、苯霜灵、恶霜灵和甲呋酰胺干扰核酸的合成单基因变异甾醇生物合成抑制剂类DMIs：三唑类、咪唑类和嘧啶类抑制甾醇14–а–脱甲基酶P450的活性①ABC运输体基因过量表达，将SBIs杀菌剂泵出病原菌；②CYP51基因发生点突变或表达水平的上升；③△14还原酶的过量生成或对药物亲和性的降低；④菌体通过代谢解除DMIs杀菌剂的毒性△8~△7异构酶及△14还原酶抑制剂：吗啉类和哌啶类抑制△8~△7异构化酶或△14还原酶的活性甲氧基丙烯酸酯类嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺和肟菌酯干扰病原菌能量的合成细胞色素b基因发生突变蛋白的192~202个氨基酸上会发生基因突变，这类突变会导致β–微管蛋白的三维构象发生变化，从而阻止药剂与β–微管蛋白的结合，使病原真菌产生抗药性。对田间抗药菌研究表明其突变位点主要集中在氨基酸的198位和200位［10］，其它位点上的突变往往导致竞争力的减弱，因而在田间不易出现。但玉蜀黍赤霉菌（Gibberellazeae）［11］和马铃薯干腐病菌（G.pulicaris）［12］对苯并咪唑类杀菌剂抗性菌的β–微管蛋白基因并没有发生改变，说明在不同病菌中或者在镰刀菌中对该类药剂发生抗药性突变的位点不同。2.2　二甲酰亚胺类二甲酰亚胺类杀菌剂是20世纪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