植物细胞工程制药

第五章植物细胞工程制药1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。2.采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。第一节概述利用组织和细胞培养技术生产药用成分植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量培养周期短，有利于节约成本大规模生产与哺乳动物细胞培养系统相比，植物表达系统具有耗费极低而生产蛋白复合物量大的潜力，而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病毒病原体的污染问题。植物组织（细胞）培养的次生代谢产物见表5-1一、植物细胞工程发展简史1902年，德国Haberlandt提出了细胞全能性学说，并进行了植物叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验,奠定了细胞工程的基础。之后至30年代，建立了基本的植物组织培养技术50年代期间，组织培养进入新的阶段培养基的设计生物反应器培养动力学等用于次级代谢产物的调控研究80年代后，高速发展时期分子生物学技术改变植物遗传特性植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为主流目前，我国处于此方面的领先二、植物细胞的药用成分市售中成药的25%来源于植物提取药物或半合成药物一类为植物后含物，为细胞储液或废弃物，包括生物碱、挥发油和有机酸。一类为生理活性物质，如酶、维生素、植物激素、植物杀菌素等三、植物细胞的生物学特性细胞的全能性:一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。植物干细胞：植物胚性细胞（embryogeniccells）即合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化的细胞要表现全能性，首先要脱分化形成分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。外植体(explant)：植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，既是组织，又是脱分化细胞Callus毛状根(hairyroot)：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。次生代谢产物：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。合成途径见表5-2毛状根第二节植物细胞的培养植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株细胞培养主要生成次生代谢产物基本技术：植物材料的准备培养基制备培养方法的选择一、植物细胞的培养特点植物培养细胞四个生长时期特性延迟期：细胞数恒定，高RNA含量，高蛋白质合成能力；加速期：细胞快速生长期。干重恒定，细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力减少；对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退；稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及有机化合物的高浓度。（1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，次生代谢产物在稳定期积累（2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。（3）植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌，但细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁二、植物细胞培养基植物细胞生长代谢特点：（1）需大量无机盐（2）需多种维生素和植物生长激素（3）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（4）以蔗糖为碳源培养基配方见表5-3常用培养基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米勒、改良怀特、尼许等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡。B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用。White的无机盐含量较低，适于生根培养。KM-8p主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复杂，它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。凡是花药培养中常用的培养基，其成分较简单，且KN03和(NH)2N04含高。（一）无机盐大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（二）生长因素植物生长调节剂植物生长激素：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获得最大量的次生代谢产物生长素（用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化）：组织培养中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一个被发现和人工合成的的激素二氯本氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；对氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：6-苄基嘌呤(BAP)6-苄基腺嘌呤(6-BA)激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)异戊烯氨基嘌呤(2-ip)植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例：高浓度生长素和低浓度分裂素——刺激细胞分裂低浓度生长素和高浓度分裂素——刺激细胞生长（三）诱导子(elicitor)：刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质,可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力,引起代谢通量和反应速率的改变,提高次生代谢产物的产量。非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金属盐类生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体真菌培养物滤液等（四）碳源细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳源。（五）维生素：烟酸，B1，B6（六）有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取液等。三、植物细胞生物反应器植物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢产物累积与细胞生长关系的复杂性，，选择合适的培养方法和反应器影像产物产量细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，生物反应器技术还有待深入各种生物反应器性能比较不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的培养。一般来说，悬浮培养的细胞在干重不大于20g/L时，以气升式反应器为宜，而当干重超过20g/L时，则改进的搅拌式生物反应器优于其它类型的反应器我国发明的“气升内错流”式植物细胞培养反应器，能够适应植物细胞培养周期长，培养液随培养进程而蒸发减少的生物反应过程；可抑制气泡的聚合，减弱气泡在液面破裂时产生的冲击力对细胞的损伤；可提高降液区气含率，消除降液区缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低反应器高度。使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时细胞量达到12gdw／L，紫草宁含量达到了细胞干重的10％，是天然植株含量的2～8倍四、植物细胞的获得和扩大培养（一）植物细胞的获得1.外植体直接分离法:机械切割、组织破碎直接从植物外植体中分离2.愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞（二）植物细胞的培养方法1.单细胞的培养（1）看护培养法（nurseculture）：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使持续分裂增值等。即愈伤组织看护单细胞（2）微室培养法：单细胞接种到小室里，密封培养，观测单细胞的生长发育情况（3）平板培养法：单细胞接种于固体培养基上，获得单细胞形成的细胞系（4）条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系。条件培养基指培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。2.单倍体细胞的培养（花药培养）：指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象用花粉在固体培养基上培养3.愈伤组织培养愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分化细胞，具再分化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可再生为植株。4.毛状根诱导和培养一些次生代谢产物只有在根里生长发根农杆菌感染双子夜植物，RI质粒诱导产生毛状根。形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。用发根农杆菌经直接注射法，外植体接种感染，原生质体共培养法诱导毛状根发根农杆菌转化后，经筛选鉴定低盐浓度下生长，培养植物细胞培养工业化存在的问题生长缓慢,通常完成一次生产周期需4-5周次级代谢物含量低培养细胞不稳定等多数产物积累于胞内不耐受剪切力一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于1000美元/kg时，才考虑采用植物细胞培养方法。第三节转基因植物一、转基因植物的产生和发展（一）转基因植物的基本概念转基因植物：遗传修饰体(geneticallymodifiedorganisms,GMOs)近年发展迅速应用广泛世界第一例转基因植物-烟草1983年在美国问世。1986年,首批转基因植物-抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1992年中国成为世界上第一个转基因植物商品化种植的国家，开创了转基因植物商品化应用的先河；当时种植的是一种抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒双价转基因烟草。（二）转基因植物的几大类型1.抗除草剂:除草作用的酶和蛋白质基因;以除草剂为底物的酶的基因转移2.抗虫:从细菌中、植物组织中和动物体内分离出相关抗性基因,转入植物中3.抗病4.抗逆境:抗旱、抗寒、抗热和抗盐5.品质改良6.代谢修饰7.生产药物二、转基因植物技术原理和方法（一）基因获得（1）氨基酸序列反推核酸序列，合成探针，从基因组或cDNA文库中筛选利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子;效率低;未知基因及产物分离蛋白质明确氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成（2）分离蛋白，制备抗体，用抗体从cDNA表达文库中筛选（3）根据数据库信息，利用保守区域制备PCR引物，进行扩增（4）以其他物种的类似基因为探针，杂交分离相应基因（二）外源基因导入1.载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多、机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统TumorinducedbyA.tumefaciens冠瘿瘤过程：先将带有目的基因的质粒整合到农杆菌基因组中，再将此农杆菌与植物细胞共同培养36～48h，转化植物细胞，然后分离洗涤去菌后通过组织培养获得转基因植物或形成冠瘿瘤和发状根等组织，这些组织也就是一种天然的选择标记。(1)根癌农杆菌转化系统。含有Ti质粒，感染双子叶植物时，质粒中DNA整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制。随后T-DNA携带的基因在植物中表达出相应的蛋白质。Ti质粒是约160-240kb的环状DNA分子。Ti质粒具有两个区域，T-DNA和毒性区域(vir)还具有冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)。T-DNA区包括：章鱼碱合成酶基因nos植物生长素生物合成酶基因Tm1,Tm2植物分裂素