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第十四章酶的非水相催化观念的改变•有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。•近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueousenzymology)。观念的改变新酶促反应体系的发现,拓宽了酶催化反应的应用范围,使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法;Margolin等研究了在无水吡啶中以枯草杆菌蛋白酶为催化剂的选择性酰化反应该反应可以得到1位选择性酰化产物;传统的化学法是无法区分这些二级羟基的,显示了酶法合成的优越性.非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究20世纪初，Bourquelot等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多1966年以来，Dostoli和Siegel分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力1975-1983年，Buckland和Martinek等探讨了微生物细胞、游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成脂和类固醇及缁醇转化1984年Klibanov在《Science》上发表关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，标志着该领域的研究取得突破性进展酶在有机介质中的催化的确立1984年美国KlibanovA.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，在仅含微量水的有机介质中成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。KlibanovA.M.结论：只要条件合适，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶可在水与有机剂互溶体系、水与有机剂量组成的双液相体系、仅含微量水或几乎无水的有机剂中表现出催化活性。为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，至少是酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差4个数量级。因此认为酶分子结构的动态变化很可能是主要因素.北口博司认为酶分子的“紧密”和“开启”两种状态处于一种可动平衡中，表现出一定柔性。有机溶剂中酶分子和水合作用、蛋白质柔性和酶活力之间和关系比过去的认识要复杂得多。酶结合水酶水或有机剂第一节酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同酶的非水相催化类型主要包括:一、有机介质的酶催化；二、气相介质的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；四、离子液介质中的酶催化go有机介质的酶催化•指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应;•适用范围:底物或产物或其一为疏水性物质的酶催化作用;•原因:酶在有机相中能保持结构的完整;•特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；•应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：水果、蔬菜的褐变就是由于果蔬类中含酚类物质和多酚氧化酶，破损时与氧气接触，发生上述反应而变为褐色。因此，在水相中无法得到邻醌类化合物或邻酚类物质；但在氯仿中酶催化反应生成的邻醌类化合物不易发生聚合，从而可得到邻醌类化合物。因此研究非水相酶催化反应很有必要。气相介质的酶催化•指酶在气相介质中进行催化反应；•适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；•特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水相中明显不同；有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；Hwang等研究了固定化醇氧化酶在气相中的催化反应生物酶用于气相催化不适用于糖氨基酸等不易挥发的底物但它将来可用于某些易挥发产品的工业生产以及有害气体的分析和处理Back超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；超临界流体指温度和压力超过临界点的流体；supercritical状态，简称SC状态；由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的物理化学性质。与常用的有机溶剂相比，超临界流体特别是SCCO２、SCH2O还是一种环境友好的溶剂。要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。常用的超临界流体有：CO2,SO2C2H4,C2H6C3H8C4H10等。优点：1)与水相比较，脂溶性反应物和产物可溶于超临界CO２中，而酶作为蛋白质不溶解，有利于三者的分离；2)产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，可解决环境污染问题；3)与有机溶剂体系相比，CO２无毒，不燃烧、廉价、无有机溶剂残留之虞；4)CO２超临界体系具有气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力使底物向酶的传质速度加快从而使反应速度提高，且在临界点附近，溶解能力和介电常数对温度和压力敏感，故反应速度提高。亦可以控制反应速率和反应平衡；5)可简化产物的分离，有可能将反应和分离过程耦合。已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。反应条件温和，反应温度低于50℃Back离子液介质中的酶催化•指酶在离子液中进行催化作用；•离子液Ionicliquids(ILs)是有机阳离子、有机阴离子在室温下呈液态低熔点盐类，挥发性好，稳定性好；•特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。总结•在酶非水相催化中研究最多的是有机溶剂;•1984.Kilibanov指出酶可在水与有机溶剂互溶体系、或组成的两相体系、或微水体系中进行催化；•包括水解酶、氧化还原酶、醛缩酶等十几种酶均可在有机剂中催化；•非水酶学与非水介质中酶催化应用取得了显著效果。第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响go一、有机介质反应体系•1、微水介质体系；•2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系；•3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；•4、（正）胶束体系；•5、反胶束体系。1、微水介质体系•是有机溶剂和微量水组成的反应体系;•微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要;•另一部分水分配在有机溶剂中;•酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中;•是常见的有机反应体系.2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系•由水与极性较大的有机溶剂互混组成；•水与有机剂含量均较大；•适用的酶较少；•辣根过氧化酶（HRP）应用：•催化酚类或芳香胺类聚合成聚酚或聚胺类物，在环保黏合剂、导电聚物、发光聚合物材料中有重要作用。3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系•由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；•游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机相；•固定化酶在界面；•催化反应在两相界面进行；•适于底物或产物属于疏水化合物的反应。4、（正）胶束体系大量水溶液中含少量与水不溶的有机溶剂，加入表面活性剂形成水包油微小液滴；表面活性剂极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂包在液滴内部;酶在水溶液中,疏水底物或产物在胶束内,反应在胶束界面进行.水相有机相酶5、反相胶束体系•反相胶束:在与水不互溶的在量有机溶剂中,加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴；•1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；•酶分子处在反胶束内，稳定性好；•反胶束与生物膜有相似之处，适于研究生物膜表面酶的结构、催化特性、动力学特性。水相有机相酶不同类型的酶在反相胶束中的排布模型二、水对有机介质中酶催化的影响水的影响水在酶催化反应中发挥着双重作用:一方面,水分子直接或间接地通过氢键疏水键及范德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象,与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活性是至关重要的,称之为必需水,不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不同的;水的影响另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活:(1)形成不规则结构;(2)二硫键受到破坏;(3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸;(4)天冬氨酸肽键发生水解.因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.1、水对酶分子空间构象的影响•无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层;•必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量;•不同的酶所需求的必需水的量差别较大;•每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需3.5×102个水分子•原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。结合水含量(%)酶周围水分子个数作用0~70~60有助于蛋白质侧链残基的离子化7~2560~2207%水分子在其他极性部位形成簇，25%肽键的氨基被水合，蛋白质结构基本不变，酶活不变25~38220~300肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶活随含水量增加而增加。38300整个酶分子被一层单分子水层包围酶活力是水溶液中的１/10。2.水对酶催化反应速度的影响•典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。•水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。有机溶剂中酶含水量最适水量，酶构象过于“刚性”而失活；有机溶剂中酶含水量最适水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活；最适水量：酶活性最大，保证酶的极性部位水合，表现酶活力所必需蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间的最佳点平衡点，同一种酶，反应系统的最适水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质核修饰性质有关有机介质中含两类水：结合水、游离水；在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大；然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响；为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用水活度（aw）描述有机介质中酶催化活力与水的关系：水活度：体系中水的逸度与纯水逸度之比；用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示；Aw=P/PoP：一定条件下体系中水的蒸汽压Po:相同条件下纯水的蒸汽压水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用水活度作参数更确切；3.水活度（activityofwater)三有机溶剂对有机介质中酶催化的影响有机溶剂影响•有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:•一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;•二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行;•三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用1.有机溶剂对酶结构与功能的影响在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象；有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有的酶分子则保持完整；（1）有机溶剂对结合水的影响•一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水而导致酶失活。•酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参数有关。•由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。2.有机溶剂对酶活性的影响（2）溶剂属性(极性)与酶活力的定量关系酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；研究最多的是酶活力与溶剂极性参数lgP之间的关系；P：指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数，lgP越大，极性越小；Laane的实验发现：lgP2的极性溶剂中，由于溶剂极性强，易夺取酶分子表面水层而降低酶的活力。lgP4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想。2lgP4，酶活力中等。３、溶剂对底物和产物分配的影响•溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。•溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；②有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低；故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为宜。•Yang等发现：溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物溶剂化上，