骨髓检查及细胞化学染色检验

骨髓检查及细胞化学染色检验湖南省第二人民医院邹国英8523228113874879971骨髓检查及细胞化学染色检验掌握：•常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶染色、碱性α-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方法、结果分析和临床意义。骨髓检查及细胞化学染色检验熟悉：•正常血细胞对化学染色的反应。骨髓检查及细胞化学染色检验了解：•流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。•染色体分析在临床血液学中的应用。•分子生物学检查在血液学中的应用。•常用FISH技术的种类、原理、方法和临床应用。•常用造血干/祖细胞培养的种类、原理和临床应用。•非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和方法。聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法。以PCR为基础的相关技术。基因芯片技术。•细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特征。细胞凋亡的机制。细胞化学染色检验•细胞化学染色，是一种以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质作定位、定性及半定量分析的方法。细胞化学染色检验•血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。•血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。细胞化学染色检验基本步骤•固定：蒸汽、液体固定•有色沉淀反应：偶氮偶联法、普鲁士蓝反应、雪夫反应、联苯胺法•复染细胞化学染色检验临床意义•辅助判断急性白血病的细胞类型•辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断•观察疾病疗效和判断预后•探讨某些疾病的发病机制一、过氧化物酶染色（POX）原理：•粒细胞和单核细胞胞浆中含有的髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆内酶所在的部位。POX结果判断细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。（－）无颗粒沉着；（a）（±）颗粒细小，分布稀疏；（b）（+）颗粒较粗，局灶分布；（c）（++）颗粒粗大，分布较密，占胞质1/2~2/3；（d）（+++）颗粒粗大，呈团块分布；（e）（++++）全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核（f）。各种细胞过氧化物酶染色嗜碱粒细胞嗜酸性粒细胞原幼粒细胞骨髓片POX染色临床意义POX染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的首选、最重要的细胞化学染色。（1）粒系：POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。嗜碱性粒细胞为阴性。（2）单核细胞：原始单核细胞为阴性反应，幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。临床意义（3）其他细胞淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。（4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FABM7的识别。临床意义骨髓片POX染色APL：呈强阳性反应AML-M4：部分呈阳性反应，部分成弱阳性反应AML-M5：呈弱阳性ALL：呈阴性，3%临床意义•（5）过氧化物酶染色•主要用于鉴别急性白血病类型，•急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，M1和M5型反应较弱，•故有助于区别M3和M5型。•急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）原理：（偶氮藕联法，Kaplow）•中性粒细胞内碱性磷酸酶（neutrophilicalkalinephosphatase,NAP）在pH9.2~9.8时，能水解磷酸萘酚钠，释放出磷酸与萘酚，再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色沉淀于胞质内酶所存在的部位。NAP结果判断阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀①（－）胞浆呈淡红色，为0分。②（＋）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。③（＋＋）胞质深褐色沉淀，为2分。④（＋＋＋）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。⑤（＋＋＋＋）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。NAP积分法计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。例如：NAP反应结果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）204020155积分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。中性粒细胞NAP活性积分值一般为10～50分，但有时可高达162分。临床意义（1）生理变化：新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高；月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常；妊娠期2-3月轻度增高，以后逐渐增高，分娩时达到高峰，产后恢复正常。（2）、病理变化增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。三、苏丹黑染色（SBB）原理：•苏丹黑B（sudanblackB,SB）是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。结果：脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中（+）颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的1/4有致密的颗粒。（++）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。（+++）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。（++++）颗粒极密，颗粒间无间隙。各种细胞苏丹黑B染色临床意义苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似主要用于急性白血病类型的鉴别。苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感，但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性）。M1-SBB(+)M2-SBB(+)四、铁染色原理：骨髓中的含铁血黄素（细胞外铁）和中、晚幼红细胞胞浆中的铁蛋白聚合物（细胞内铁）经普鲁士蓝反应形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于细胞内外铁存在的部位。正常人骨髓细胞外铁为+~++。铁粒幼细胞阳性率为12%~44%。铁染色（ironstain；IS）中的细胞外铁反映骨髓中铁的储存量，细胞内铁反映骨髓中可利用铁的量。结果判断（1）细胞外铁的观察：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。以油镜观察定级标准（-）无铁粒可见。（+）少数铁粒或铁小珠。（++）较多铁粒和铁小珠。（+++）很多铁粒、铁小珠和少数小块。（++++）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。正常范围：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3细胞外铁观察•阳性为蓝绿色沉淀++++血色病+++AA、铁粒幼贫血++感染+++AA、铁粒幼贫血+NBM—IDA结果判断（2）细胞内铁观察：细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒，以油镜计100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色小颗粒（即铁粒红细胞）的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下四型：Ⅰ型：仅含1-2个铁颗粒。Ⅱ型：含3-5个铁颗粒。Ⅲ型：含6-10个以上铁颗粒。Ⅳ型：10个铁颗粒。正常范围：12%~44%，平均21.4%，多见Ⅰ型，少见Ⅱ型，无Ⅲ、Ⅳ型。细胞内铁结果判断（3）环形铁粒幼红细胞：指含铁颗粒6个，其中1/2以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6%环形铁粒幼细胞临床意义1．缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁明显减少，为“一”~“士”，细胞内铁平均5.9%，仅为I型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。2．铁粒幼细胞性贫血时，外铁“2＋”一“3＋”，内铁平均70%，其铁粒粗大，以Ⅱ～Ⅳ型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。3.非缺铁性贫血如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别的参考。4.继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。五、过碘酸-雪夫染色（PAS）原理：•过碘酸-雪夫（Periodicacid-schiff，PAS）染色又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（Periodicacid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。PAS结果判断细胞质内有出现红色颗粒、块状或呈弥漫状红色者为阳性。①（－）胞质无色，无颗粒。②（+）胞质淡红色或有少量红色颗粒，通常＜10个颗粒。③（++）胞质红色或有10个以上红色颗粒。④（+++）胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色块状。⑤（++++）胞质呈紫红色或有粗大红色块状。临床意义（1）M6与巨幼贫的鉴别M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。（2）急性白血病的类型鉴别ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。PAS染色AML-M6幼红细胞呈阳性反应MA幼红细胞呈阴性反应ALL-L1L1PAS(+)AML-M5M5PAS(+)AML-M6AML-M6PAS(+)AML-M7M7PAS(+)（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。（4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：•细胞内的氯乙酸AS－D萘酚酯酶（naphytholAS-Dchloroacetateesterase,NAS-DCE）水解基质液中的氯乙酸AS－D萘酚，产生AS－D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所存在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NAS－DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。结果判断阳性结果为胞质内出现红色沉淀①（－）胞质无色。②（＋）胞质呈淡红色。③（＋＋）鲜红色沉淀布满胞质。④（＋＋＋）深红色沉淀充满胞质。临床意义•1．急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞NAS－DCE染色多呈（＋）~（＋＋）。白血病性早幼粒细胞呈（＋＋）~（＋＋＋）。•2．急性单核细胞白血病原、幼单核细胞多呈阴性反应。•3．急性淋巴细胞白血病原、幼淋巴细胞呈阴性反应。。七、中性非特异性酯酶染色原理：•中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-Dacetateesterase,NAS-DAE)染色和α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）染色。细胞内的α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）在pH中性的条件下水解基质液中的α-醋酸萘酚，释放出α-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色，α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。结果判断阳性结果为胞质内出现蓝色或棕黑色颗粒沉淀①（－）无颗