氨基甲酸酯类农药检测用免疫传感器的研究

氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器的研究TheStudyofImmunosensoronCarbamatePesticidesResidueDetection摘要：近年来，食品生物安全问题越来越受到各国政府和百姓的重视，寻找一种优良的检测方法成为当前食品安全监督部门的当务之急。农药残留成为危害食品安全的重要问题之一，这就对食品农药残留的快速检测提出高要求。生物传感器技术具有快速、灵敏、特异、简便等特点，在食品检测领域具有广阔的应用前景，因此生物传感器作为一种新的检测分析工具，在检测食品农残中具有广泛的应用前景。本文主要介绍免疫传感器的特点、优点、国内外的研究现状、存在的问题及我们要研究的氨基甲酸酯类农药检测用免疫传感器的内容和预期达到的效果。关键词：农药残留；生物传感器；检测Abstract:Inrecentyears,governmentsandpeoplepaidmoreattentiontoproblemoffoodbio-safety.Findinganexcellentmethodtosolvetheseproblemsbecomesanurgentworkinfoodsafetysupervisiondepartments.Theoneofthemostimportantproblemsforharmingfoodsafetyisthepesticideresidues,andarapiddetectionofpesticideresiduesinfoodmakehighdemands.Becauseoftheexpert,sensitive,quick-respondingreactionandsimple,biosensoriswidelyappliedinthefoodanalysis.Sobiosensorasanoveldetectionandanalysistoolsarewidelyusedindetectionofpesticideresiduesinfood.Inthispaper,thecharacteristics,theadvantage,researchhomeandabroad,openquestionsofimmunosensor,aswellasthestudyofimmunosensoroncarbamatepesticidesdetectionwerediscussed.Keyword:carbamatepesticideresidue；immunosensor；detection引言农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草等危害的防治有着不可替代的作用，由于使用农药我国每年仅粮食一项就挽回损失约占总产量的7%。由此可见，农药的发明和使用给农业生产带来了革命性的变化，而且在农业生产中发挥着越来越重要的作用。虽然农药在我国农业生产中有着不可替代的作用，但由于农药的不合理使用，导致很多农产品中农药残留超标，这严重威胁了人类的饮食安全[1]。农药残留是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称，不仅对环境造成了极大的污染，同时，通过食物链的富集作用，进入人体，对人体产生各种危害。1.氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器研究的意义食品安全问题除了作为重大公共卫生问题外,也是一个社会问题,涉及到管理监督水平、食品生产经营者的素质、全社会消费观念等。然而,长期存在的科技“瓶颈”是影响我国食品安全的重要因素。为了能够改善我国食品安全现状、减少食源性疾病的发病率、更有效的对市场进行卫生监管,对于关键检测技术的研究非常重要。1.1农药残留的传统检测方法农药残留分析既要有精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术。经典的分析方法,如液相色谱（LC）、气相色谱（GC）以及超临界流体层析等分析方法。目前实验室使用最多的农药检测方法是高效液相色谱法（HPLC）和气象色谱-质谱（GC-MS）以及特异性检测如电子捕捉检测、氮磷检测已与质谱分析法结合并应用于农药残留包括主要的农药代谢物和降解物分析[2-4]。这些分析方法虽然具有高选择性，但是操作繁琐、耗时长、成本高，并且要求对样品进行预浓缩和衍生处理，难以得到广泛的应用。因此,人们迫切需要快速、可靠、经济和适合于现场应用的快速检测方法。于是,廉价、快速、可信、敏感的生物传感器应运而生。与传统的分析方法相比,生物传感器具有如下特点：①待测的样品不用经过预先处理，,除缓冲液外无需其他试剂，可以同时对样品进行分离和检测。②专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。③分析速度快，可以在一分钟得到结果。④准确度高，一般相对误差可以达到1％。⑤操作系统比较简单，可以实现连续监侧，容易实现自动分析⑥成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。⑦有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。⑧敏感物质经固定化可重复使用。⑨响应快,样品用量微传感器连同侧定仪的成本远低于大型分析仪器,便于推广普及[1-3]。1.2生物传感器简介根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件用于农药残留的生物传感器可分为五类：酶传感器（enzymesensor），微生物传感器（microbialsensor），压电生物传感器（piezoesensor）和免疫传感器（immunolsensor），显而易见，所应用的敏感材料依次为酶、微生物个体、抗原和抗体。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器。相对于强特异性的免疫传感器而言前几种生物传感器分别存在，酶的价格较高、稳定性稍差；稳定性和选择性不高；增加了操作时间,蛋白质活性在干燥过程易受到损害，更突显了免疫传感器的优越性。免疫反应一般难以检测到小分子物质,通常用荧光素、放射性同位素或酶等物质来标记抗原或抗体,然后用现代测试仪器检测。免疫分析分类方法较多,按标记技术的不同可分为酶联免疫吸附分析法、生物发光免疫分析、荧光标记免疫分析及化学发光免疫分析等;按反应体系物理状态的不同可分为均相免疫分析和非均相免疫分析。电化学免疫传感器是生物技术和电化学技术相结合的产物，而免疫感受器在检测过程中只有抗体和抗原污染物结合没有化学反应，需要其他体系帮助才能完成信号的转换和放大[5-7]，在早期的免疫传感器中较多的使用酶标抗体或抗原，但是酶标的步骤繁琐，且酶易失活，研究一种无标记得电化学免疫传感器受到很多学者的重视。1.3氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器研究的目的本研究重点研究了无标记免疫传感器的设计方法如应用了自组装技术，凝胶溶胶技术，定向固定技术，纳米固定技术等将无标记的抗原或抗体固定在电极上，优化出最适宜的固定方法，进一步降低检测限，并应用于果蔬中农药残留的检测。在目前的研究基础上免疫传感器的发展还存在很多问题：为了保证生物传感器的高稳定性和高灵敏度，应当使尽可能多的高特异性抗体或抗原分子与固相载体结合。为了缩短生物传感器的感应时间，延长使用寿命，如何将基膜尽可能的做薄则成为另一个难题；如何使生物传感器在使用环境中更加稳定也需要进一步的研究。2.该领域目前的国内外研究水平和发展趋势免疫分析法(Lnmunoassay)正是基于抗原和抗体特异性结合前后物理和化学性质的变化建立的分析方法。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器。免疫生物传感器以免疫生物分子作为识别元件，通过固定化技术将免疫蛋白结合到感受器表面，发生免疫识别反应后，生成的免疫复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，如电信号、光信号或者声波信号等，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而可实现对待测分子的快速灵敏检测。因此免疫生物传感器主要由生物识别系统(感受器)和换能器等元件组成。由于生物传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要用途，以及其具有体积小、精度高、专一度强、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时在线活体检测等优点，己成为当前研究的热点课题之一。2.1国内研究现状西南大学的袁若课题组在免疫传感器方面的研究较为系统，该课题组研究了无标记免疫传感器的多种固定材料，首先基于纳米材料如：纳米金、铁氰化镍纳米颗粒、二氧化硅-亚甲基蓝纳米复合物、碳纳米管、纳米银等纳米材料的优异的电子传输能力，以此为基础的固定方法近期研究较多；其次研究了几种基于分子膜如：有机-无机氧化还原复合膜、纳米结构功能膜、功能化壳聚糖生物复合膜、Nafion膜等应用于固定的材料。从另一个大方面来说，该课题组研究了免疫传感器的多种检测方法如：应用于检测目标物的电位型免疫传感器，电流型免疫传感器和酶电流型免疫传感器。使用了包括电沉积媒介体、电聚合、层层自组装、多层自组装、静电吸附技术制备了系列的无标记的免疫传感器用于抗原浓度的检测[7-14]。中山大学的蔡沛祥课题组在无标记免疫传感器方面的研究的成果也较为突出，研究了酶和其它分子的生物杂化膜、双层类脂膜、自组装膜和凝胶溶胶膜为基础的免疫传感器。其中特别是凝胶溶胶技术和改进的可再生凝胶溶胶技术因其制作简单，通过优化影响免疫反应的多种因素如：电解质、pH、温度等，可得到系列稳定性较高的免疫传感器用于目标物的检测[14-15]。宁波大学的干宁研究组利用多层自组装技术制作了一系列的安培型免疫传感器，主要用于农产品和水产品中的真菌毒素（黄曲霉毒素）和抗生素的检测。另外在医学上应用的传感器的制作也有一定得成绩，在电极的再生和一次性使用的成本较低的免疫传感器方面也有进展[16]。中国科学院电子学研究所传感技术联合国家重点实验室边超课题组对免疫传感器做了大量的研究，主要在免疫微传感器和免疫微传感芯片方面研究，其中包括了电位型和电流型微传感器，采用了电聚合膜、凝胶溶胶、蛋白A定向固定等技术制的稳定的免疫传感器用于了医学、食品安全等许多方面的检测[17]。江南大学的孙秀兰等人对无标记的阻抗性电化学免疫传感器进行了研究[18]，优化了初始电位、抗体固定质量、抗原抗体孵育时间等，进而得到了性能可靠的免疫传感器。在溶胶凝胶和自组装方面也进行了研究。浙江大学的应义斌研究了压电免疫传感器在电极表面固定有机磷单克隆抗体，使用直接免疫的方法检测有机磷农药的残留，对多种固定方法进行比较，在0.005～10µg/mL范围内呈现良好的线性范围，其检测限为2.16×10－3µg/mL[19]。此研究为国内使用直接免疫方法检测农药残留的典型例子。2.2国外研究现状YanbinLi[20-22]课题小组研制了一系列的无标记的阻抗型的免疫传感器用于致病菌等方面的检测，其研究了叉指型阵列微电极传感器的制备及应用，并使用阻抗方法为检测方法。在具体的组装过程中使用磁性纳米微粒材料，得到了较理想的检测限。Enrique[23-26]在免疫传感器方面也做了大量的研究，在农药残留检测中做了莠去津的检测，其课题组使用的是叉指型电机，为了扩大免疫传感器的响应电流使用纳米金标记的抗体，也使用了固定抗原的方法，对实验进行了一系列的优化，进而得到了2–3μg/L。Mani[27]利用标记了磁珠的抗体研制了超灵敏的免疫传感器，利用的磁珠的直径大约是1×10－3mm，对待侧样品的最低检测限达到5fg，灵敏度是已研究方法的8倍。其免疫传感器的制作过程如下：此方法同ELISA和仪器分析的结果相比较吻合度较好。RonghuiWang[28]对叉指型阵列电极的研究较多，基于阻抗型制作的叉指型阵列微电极作为一种新颖的具有高灵敏度和高特异性的方法应用于医学等其它方面的研究，研究中表明了微电极的电阻随着蛋白A的固定，抗体在电极表面的固定和辣根过氧化物酶（HRP）对免疫传感器的封闭步骤的进行而逐步扩大，在抗原和抗体的特异性反应中电阻值进一步扩大，况且扩大值与待测物的浓度成比例，从而得到待测物的浓度。此研究的优很突出，首先使用在电阻测量方面有优势的插指型阵列微电极，可以起到放大