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第8章病毒的遗传分析本章重点:以噬菌体为材料1、分析基因的精细结构2、基因定位与遗传作图病毒（virus）既不属于原核生物，也不属于真核生物，属非细胞型生命形态，又称为分子生物。其一般特点是：个体极小：介于20～300nm之间,能够通过细菌滤器；无细胞结构：仅含一种类型的核酸（或DNA或RNA），其主要成分是蛋白质和核酸；没有完整的酶系和蛋白质合成系统，离体条件下，以无生命的化学大分子状态存在，可形成结晶，不能进行独立的代谢活动；严格的活细胞内寄生，以复制的方式增殖；对抗生素不敏感，但对干扰素敏感通常按宿主类型病毒分为：1.噬菌体（bacteriophage或phage）:细菌病毒、真菌病毒及藻类病毒2.植物病毒(plantvirus):感染高等植物、藻类等真核生物的病毒3.动物病毒：昆虫病毒和脊椎动物病毒8.18.1.1病毒的形态结构与基因组病毒的形态结构病毒的形态结构只能借助电子显微镜才可以观察到。成熟的具有侵染力的病毒个体称为病毒粒子（毒粒），病毒粒子是一种包括核酸和结构蛋白或被膜的一个完整的病毒颗粒，其体积大小相差悬殊，绝大多数直径在10～300nm之间。其形态多种多样，但基本形态有杆状，如烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）呈直杆状,腺病毒（adenovirus）呈球形蝌,蚪状为大部分噬菌体的典型形态，如λ噬菌体和T偶数噬菌体均为蝌蚪形（图8－1）。基本结构核心+衣壳（核衣壳）核心:DNA或RNA衣壳由许多蛋白质亚单位衣壳体以对称的形式，规则排列而成。有的病毒在核衣壳外还有囊膜、包膜、被膜、外膜等结构，膜的表面还有突起：刺突、囊膜粒等。8.1.2病毒的基因组已知病毒基因组的结构类型多种多样，根据病毒基因组的结构、以及其转录mRNA、指导蛋白质合成与病毒复制表达的特点，基本上可以将其分成6种类型：双链（ds）DNA病毒基因组单链(ss)DNA病毒基因组正链(+)负链(-)RNA病毒基因组RNA病毒基因组双链(ds)RNA病毒基因组反转录病毒基因组不同病毒的核酸含量差别较大，通常在1%～50%。但对每种病毒粒子而言，核酸的长度是一定的，一般由5～500kb组成。最大的病毒基因组有几百个基因最小的病毒如MS2噬菌体仅有3个基因病毒基因组编码的基因一般有：侵染功能所需的基因，如侵染中的酶；基因组复制所需的基因，如聚合酶基因；病毒体形成的基因，如衣壳蛋白基因；破坏宿主细胞的基因，如溶菌酶基因；有些病毒生活周期中任何特殊方面所需的基因，如λ噬菌体基因组与宿主基因组之间的位点专一性重组所需的基因等。反转录酶病毒外壳蛋白反转录病毒的生活史蛋白水解酶反转录病毒基因组的结构与功能及转录8.2噬菌体的增殖与突变型8.2.1噬菌体的增殖（1）烈性噬菌体（virulentphage）的增殖:感染宿主细胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。整个过程包括：吸附侵入脱壳生物合成装配和释放其感染周期有两种途径：即裂解途径和溶源途径，分别称为裂解周期（lyticcycle）和溶源周期（lysogeniccycle）（2）温和噬菌体的增殖8.2.2噬菌体的突变型（1）条件致死突变型在某些条件下，导致某些突变型致死。那么这些条件就称为限制条件，而在另一些条件下仍可进行增殖，从而得以扩增进行研究，所以这些条件称为许可条件。①温度敏感突变（temperaturesensitivemutation，ts），野生型噬菌体能在很大的温度变化范围内感染宿主并进行繁殖，而热敏感突变型（heatsensitivemutant，hs），通常在30℃（许可条件）感染宿主进行繁殖，但在40～42℃（限制条件）就是致死的，不能形成噬菌斑；而冷敏感突变型（coldsensitivemutant，cs）在较低温度下就致死。②抑制因子敏感突变（suppressorsensitivemutation，sus），sus突变的实质是原来正常的密码子变成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质。带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因（suppressor，su＋）（许可条件）的宿主菌时能产生子代，但在感染另一种没有抑制基因（su－）（限制条件）的宿主菌时，不能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。根据在带有专一性抑制基因的宿主中的非致死性，可以将sus突变分为3类：琥珀突变（amber，amb）、赭石突变（ochre，och）和乳白突变（opal，op），它们相应的密码子为UAG、UAA和UGA终止密码子不编码任何氨基酸，称为无义密码子（nonsensecodon），是蛋白质合成的终止信号。这些密码子是琥珀型（amber）UAG、赭石型（ochre）UAA和乳白型（opal）UGA。如果编码多肽链中某一氨基酸的密码子突变为终止密码子，多肽链合成到此便会中断，从而使多肽链变短而失去活性。这种突变称为无义突变（nonsensemutation）。各种无义突变都是条件致死突变，因为有相应的无义抑制基因（su＋）。这些sus突变型之所以在带有相应的抑制基因宿主中可产生后代，是因为翻译过程中，在终止密码子处插入一个特定的氨基酸，防止在终止密码子位置上提前终止。如琥珀突变就有许多种抑制基因，各插入某个氨基酸以防止提前终止（表8-3）。携带su＋突变型的菌株实质是tRNA基因发生了突变，例如表8－3中的琥珀型抑制基因su3＋在UAG密码子上插入了一个酪氨酸，这是因为tRNATyr基因的反密码子的一个突变，tRNATyr正常的反密码子是GUA，它按摆动规则译读酪氨酸密码子UAuc。su3＋菌株的tRNATyr含有反密码子CUG，它识读琥珀型密码子UAG，并插入酪氨酸而防止终止。即使抑制基因可在相应的终止密码子处插入一个特定的氨基酸而防止提前终止，但合成蛋白质的量也只有相应野生型的5%～55%（表8－3）（2）噬菌斑形态和宿主范围的突变型①噬菌斑形态突变型这类突变往往是致死的，受控制的基因大都位于基因组中狭窄的特定的区段里，而噬菌体大多数基因都涉及生命过程不可缺少的功能。但突变后有的是由于侵染宿主细胞后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑（plaque）。另一些则是由于被感染细菌全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。②宿主范围的突变型噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面的专一受体上，这是由受体的基因控制的，如果受体发生改变，有可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的宿主范围就缩小，另外,噬菌体突变也可以扩大寄生范围。尽管这些突变通常是致死的，不能形成噬菌斑，但有些突变在限制的宿主中是致死的，而在许可的宿主中则可形成噬菌斑。因而宿主范围的突变型其本质也是条件致死突变型之一。8.3.1Benzer的重组测验与基因的精细结构析(1)噬菌体的杂交和重组慨念野生型噬菌体突变型用两种突变型噬菌体感染同一宿主细菌，叫混合感染（mixedinfection）或双感染（doubleinfection）→进入裂解周期→两个噬菌体偶然地发生交换→它们的后裔可以出现重组子。因此可以进行染色体作图分析。8.3噬菌体突变型的重组测验(2)基因的精细作图——基因内重组（Intragenicrecombination)基本原理如图所示:虽然基因内重组能够发生，但实验很难做，因为在两个相同基因内的两个突变间的距离非常短，在这样一个极其小的区域，产生重组染色体的可能性仅1×10－5。真核生物如果蝇、植物这样低的频率是无法从实验上得到的。rⅡ突变型品系，在E.coli中的不同表型提供了一个实验系统，可以检测到1×10－6的重组子。1955年Benzer：细菌噬菌体遗传区的精细结构1、分离两个不同的（非互补的）rⅡ噬菌体突变子2、共感染E.coliB，形成噬菌体的新群体，E.coliB细胞逐渐裂解。3、收集裂解液，和E.coliK菌株混合后倒在固体平板上4、取一些噬菌体稀释到10－8，感染E.coliB，也取一些噬菌体稀释到10－3，感染E.coliK12(λ)5、涂布细胞，观察噬菌斑的数目Benzer利用T4的两个rⅡ不同突变型如r47＋和＋r104在许可条件下进行双重感染，即r47和r104同时侵染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑后收集溶菌液，将此溶菌液等分两份，一份再接种大肠杆菌B菌株，在大肠杆菌B菌株的细胞中r47＋、＋r104、r47r104、＋＋都能生长，故在此平板上可统计噬菌体总数；另一份溶液接种于大肠杆菌K（λ）菌株中倒平板，在这里，只有＋＋重组子才能生长（图8-4），由于rⅡ双重突变的交互重组子r47r104不能生长，所以无法检出，但是它的频率和＋＋相等，因此估算重组子数要将＋＋数乘以2，代入公式：2×rII重组噬菌体数因此可用以下公式计算相邻不同位点的遗传距离：+总噬菌体数Rf=2×在E.coliK()上生长的噬菌斑数在E.coliB上生长的噬菌斑数Rf=由于在E.coliB平板感染后得到的噬菌斑数为群体总数，在E.coliK12(λ)的噬菌斑为基因内重组所得到的野生型的噬菌体数，所以以上公式可以表示为：r47r47r47++r104r47+r47++r106+r102精细作图B菌株K菌株裂解液裂解液裂解液裂解液abcd这一测定方法称为重组测验（recombinationtest），它是以遗传图的方式确定突变子之间的空间关系（图8--5）。根据公式重组频率＝2（11×103）/6.6×109＝3.3×10－6＝0.0000033（一百万分之3.3）作图显示r+重组子最低频率，在rⅡ突变子中带有的异点等位突变是0.01%，最小的图距0.01%来对两个标记间的分子距离——以碱基对表示的距离——做一个粗略地估计。可检测到两个rⅡ突变之间重组率为0.0002%（2×1／106＝2×10－6）。但实际上所观察的最小重组率为0.02%，即0.02个图距单位，还没有发现小于这个数值的重组率（图8-6）以前用来计算重组的方法是计算基因与基因之间的距离，而Benzer的方法可以用来测算一个基因内部不同位点的距离，它的精确度可达到十万分之一，也就是0.001个图距单位，故称作基因的精细作图例：噬菌体T4＝1500mapunits(1.8×105bp)如果两个rⅡ突变子产生0.01%r+突变子，则意味突变是由0.02图单位所分开。占整个T4Genome:0.02/1500=1.3×10－5T4phage有：1.8×105bp所观察到的最小重组距离：（1.3×10－5）×（1.8×105）＝2.4bp这意味Benzer’s结果已显示遗传重组可能出现在2个碱基对顺序的距离内，后来由其他人的实验已做出结论性的说明，重组可出现在影响DNA中邻近碱基对的突变之间。也就是说：遗传实验已经说明碱基对既是突变单位（unitofmutation）也是重组单位（uniteofrecombination）(3)基因的基本概念经典遗传学基因概念：基因是一个基本的结构单位，基因内不发生重组；基因是一个基本的突变单位，基因内部没有更小的突变发生；基因是一个基本的功能单位，它决定着一个特定的表型性状。即：基因是一个重组、突变和功能三位一体的单位。现代遗传学基因概念：Gene(Cistron)isthesegmentofDNAinvolvedinproducingapolypeptideChain；itincludesregionsproceedingandfollowingthecodingregion(leaderandtrailer)aswellasinterveningsequences(introns)betweenindividualcodingsegments(exons)。基因内部可以发生重组，基因内部可以发生更小的突变一些基因可被转录但不被翻译，如rRNA，tRNA等；一些既被转录也被翻译,如Structuralgene等。8.3.2T2突变型的两点测交与作图1940年AlfredHershey&R.Rotman发现T2品系噬菌体两个特定性状：噬菌斑的形态（r－或r+）宿主范围（