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第五章、植物离体脱毒快繁技术一、病毒危害多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移，侵染病毒的种类越来越多。植物病毒病原体可通过维管束传导。因此，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。目前，对细菌和真菌侵染的病害，可通过药物处理达到治愈的目的。但还没有治病毒的特效药。种子一般不带病毒(豆类植物除外)，种子繁殖可得无毒植株。但对于无性繁殖植物，必须采取一些特殊方法脱除病毒。脱毒快繁的一般过程1、诊断：首先了解供试材料感染病毒的种类2、茎尖培养脱毒或结合热处理3、鉴定4、繁殖5、驯化移植1、热处理脱毒原理：①病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。二、脱毒方法(一)热处理脱毒依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。(1)温汤浸渍处理(2)热空气处理2、热处理脱毒方法（1）温水浸渍处理适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。（2）热空气处理热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内，一般35-40℃。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。热处理广泛应用于葡萄、草莓、马铃薯和菊花等植物。如：葡萄置于38℃可去除扇叶病毒。热处理对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒不起作用，因此，必须与茎尖培养相结合脱毒效果更好。植物的去病毒技术，实质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.1～0.5mm带1～2个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。（二）茎尖培养脱毒1、茎尖培养脱毒原理病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm）几乎不含或含病毒很少。1、传导抑制。植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。2、酶缺乏。茎尖中缺乏病毒合成所需的酶系，存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。茎尖分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：•3、能量竞争。当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。•4、抑制因子存在。在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”（抑制因子假说），在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。2、培养基一般以White、MS为基本培养基，提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培养某些植物茎尖时，有些离子浓度过高应稀释。在双子叶植物中，激素可能在第2对叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须加入生长素与细胞分裂素，浓度要合适。在生长素中应避免用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用NAA或IBA；细胞分裂素用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培养有用。材料选择、消毒微茎尖的剥取接种3、茎尖的培养方法3、茎尖的培养方法需要一台解剖镜（8-40倍）。剥离茎尖要迅速并尽快接种，或在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，以防茎尖变干。茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，(无须表面消毒)就可得到无菌的外植体。有时消毒处理会增加培养物的污染率。即：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。茎尖长（ｍｍ）叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成活，过大又不能保证完全除去病毒，所以茎尖大小要合适。剥取茎尖过程:解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当一个半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将带1-2个叶原基的分生组织切下，接到培养基上。将接种的茎尖置于22℃左右温度下。2000-3000lx16h/d光照下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。4、影响微茎尖成活及脱毒的因素（1）母体材料病毒侵染程度被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。（2）外植体大小在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。（2）培养条件在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时，光照强度便增加到4000lx。（3）外植体的生理状态茎尖最好要由活跃生长的芽上切取。取芽的时间也很重要，一般选萌动期较好。否则采用适当的处理，打破休眠才能进行。（三）茎尖与热处理相结合方法能克服单独茎尖培养时，茎尖过小成活率太低，茎尖太大又脱除不掉病毒的缺点。1、热处理后取较大茎尖培养获得脱毒苗。2、取茎尖（或茎段）培养获得无菌苗。然后将试管苗热处理，再取茎尖培养获得脱毒苗。（四）其它途径脱毒1、愈伤组织培养脱毒2、茎尖微体嫁接3、化学疗法脱毒1、愈伤组织培养脱毒愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。愈伤组织的某些细胞不带病毒原因：1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株。2、茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4-1mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。3、化学疗法脱毒病毒抑制剂三、脱毒快繁材料的选择应注意以下几点：1）品种要可靠2）要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作为脱毒材料3）名贵的植物良种4）植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好四、植物病毒的鉴定1、外观判断法2、指示植物法3、抗血清鉴定法4、电子显微镜检查法5、酶联免疫鉴定法(ELISA)1、外观判断法：带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这些表现来判断。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还不够。2、指示植物检测法：指示植物又称鉴别寄主，指的是对某种或某些特定病毒非常敏感，而且症状表现十分明显的植物。通常不同病毒应选用不同的植物。马铃薯病毒常用指示植物有千日红、曼陀罗、豇豆、辣椒等。分为2种①汁液感染法（摩擦接种法）②嫁接检测法3、抗血清鉴定法（抗原－抗体反应）原理：由于病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较好的抗原。将病毒给动物注射后产生抗体。抗原和抗体结合产生血清反应。抗原：病毒。抗体：是指生物体在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗体的血清称为抗血清。4、电子显微镜检查法直接观察有无病毒存在，并根据病毒的大小、形状和结构等来判断病毒种类。5、酶联免疫吸附测定法(ELISA)把抗原-抗体的免疫反应于酶的催化反应相结合而发展起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快应用最广的方法。原理：采用酶标记的特异抗体指示抗原-抗体的结合，从而检测样品中的抗原定量测定法。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。(3)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。(4)加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。五、快速繁殖茎尖培养得到的脱毒苗不多，用于生产需扩大繁殖。扩繁方法：1）组培快繁2）无毒苗栽到土壤中进行扩繁。如甘薯、草莓等利用蔓，马铃薯、姜、蒜等利用地下部分繁殖。为了预防病毒再感染，扩繁应在培育温室或防虫罩内，因为昆虫传播病毒。3）两种方法相结合，试管内扩繁，移栽后再扩繁。注意：1、培养变异的产生，应及时去除2、脱毒苗并非永远是无毒苗，由于昆虫等的传播，不免会再感染病毒，所以要经常脱毒，一般脱毒苗用1－3代。脱毒试管苗为原原种－－繁殖一代为原种－－原1代－－原2代枫树快繁图示枫树快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示月季快繁图示•腋芽在生根培养基中生长两周，即可有小的幼根生成，三周后，幼根可长至2cm长。•将上述月季苗经过炼苗后，从培养基中取出，小心地洗去根上的培养基，然后将其接种在培养介质中(营养土:蛭石:珍珠岩=3:1:1)，再将培养介质浇透水，用保鲜膜封上，以防止水分的散失，然后将其放在弱光、湿度大的培养室中培养，待长出新根后，可移入田间土壤中。具体过程如下图：月季快繁图示植物快繁的一般程序•1.无菌母体植株的制备：（取材、植物激素、防止褐化和有害物积累）•2.不定芽增殖：（增殖的途径：诱导形成大量胚状体；诱导形成大量不定芽；促进腋芽的快速形成；愈伤组织增殖）•3.完整植株的形成：•4.再生植株的驯化：•5.再生植株的鉴定：（植物形态学鉴定；细胞学鉴定）•（一）离体繁殖的一般技术1.外植体的选择(1)根据培养目的选择(2)考虑种质、取材大小、时期和材料的生理状态，具有代表性•2．培养物的增殖植物的种类和自然生长习性不同，其增殖方式及所采取的相应技术措施也不一样。一般来讲，培养物的增殖有以下4种方式•①芽增殖特点主要表现在培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。目前采用这一方式快速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄和月季等。•②不定芽增殖从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。•特点主要表现在繁殖系数高，有较好的遗传稳定性。•③胚状体增殖特点是增长率高，胚的双极性免去了生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。因此，目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一技术途径还没有用于植物的快速繁殖。•④愈伤组织增殖可以说，所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导形成愈伤组织,愈伤组织再进一步分化即可获得小植株。•愈伤组织增殖的特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。•3．生根培养•4．生产用苗的培植（二）离体繁殖的使用范围离体繁殖常用于以下几个方面：•某些难以繁殖或繁殖系数很低的植物•某些需要加速繁殖的特殊基因型如名贵花卉、优良资源、果树芽变体和转基因植株等•自然无性繁殖极易感染病毒的植物如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等•有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物（三）离体繁殖的遗传变异与控制•1．外源生长调节剂对品种典型性的影响•2．继代次数与变异•3．增殖方式的合理选择六、脱毒苗在生产中的应用脱毒苗用于生产可以明显提高产量和质量，一般产量可提高30％以上。目前，甘薯、马铃薯、草莓、大蒜