第五章 植物脱毒技术

第五章植物脱毒技术ProductionofVirus-FreePlants一、一般概念病虫害对农作物和园艺植物会造成很大经济损失，大量损害是由病毒引起的。例如：potato,sweetpotato,banana,cassava,sugarcane,horticulturalcrops(e.g.citrus,pome梨果andstonefruits核果类)全球每年损失US$6x1010billionGrapevine53种病毒，每年由GrapevineFanleafVirus(GFV)损失US$1.5billionPotatoLeafrollVirus(PLRV)andPotatoVirusY(PVY)areamongthemostdamagingpotatoviruses.一、一般概念大部分病毒是昆虫传播种子和花粉曾认为是无病毒，现在知道也传播大量病毒。若是使用未受侵染个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株；不过后代常常表现遗传变异性。无性繁殖的植物，都易受到一种或一种以上病原菌的周身侵染，可是无性繁殖在园艺、林业生产中又十分重要。期望去除病毒，提高产量、植物材料的国际间交流、种质保存如何获得一个不带病原菌的植株？病毒在植物体内分布是不均匀的，顶端分生组织一般说或者是无病毒的，或者是只携带有浓度很低的病毒。Holmes（1948）通过茎尖扦插(shoot-tipcuttings)的办法，由受侵染的大丽花中获得了无病毒植株；Morel和Martin（1952）建立了消除病毒的茎尖培养方法(meristem-tipculturetechnique)。二、脱毒方法1.热处理脱毒原理：在高于正常的温度下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完全地钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。方法：（1）温汤浸渍处理法：将剪下的接穗或种植材料，在50℃左右的温汤中浸渍3–15分钟至数小时；（2）热风处理法：让盆栽植株栽35-40℃高温下生长发育，热处理空气温度应逐渐升高，然后达到所需温度，同时保持一定的湿度和光照，以后可切取处理后新长出的枝条做接穗和砧木，或将热处理与组织培养结合更好。热处理脱毒缺点：（1）不是所有病毒对高温敏感（2）热处理后成活率低（3）过长的热处理使寄主植物抗性因子失活2.茎尖培养脱毒1960s后期，茎尖培养脱毒开始成为最通用的方法。优点：(i)thepotentialofremovingfungalandbacterialinfectionsfromthedonorplant;(ii)invitroclonalpropagationwithhighgeneticfidelity;(iii)thepracticalpropaguleforcryopreservationandothertechniquesofgermplasmstorage;(iv)easilyacceptablebyquarantineregulationsforinternationalexchange;(v)thetechniqueissuitableforpreciseinvitromultiplicationofChimeras嵌合体.茎尖无病毒的理由：(i)Virusmultiplicationisdependentonthemetabolismofthehostplant.Highmetabolicactivityintheactivelydividingmeristematiccellsdoesnotallowvirusreplication；(ii)Therapidspreadofvirusesintheplantisthroughthevascularsystemwhichisabsentinthemeristem.Thosevirusesinvadingnon-vascularregionsmovefromcelltocellviatheplasmodesmatal(胞间连丝)connections,whichisratherslowtokeeppacewithrapidlygrowingtipregion;(iii)Ahighendogenousauxinlevelintheshoottipsmaybeinhibitorytotheviruses;(iv)Themeristemisprobablyprotectedbycertain‘virusinactivatingsystems’.2.茎尖培养脱毒茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎尖存活率低）培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱毒效率。培养条件：同一般茎尖培养外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取3.愈伤组织培养脱毒在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致地带有病原菌。由受MTV侵染的烟草愈伤组织分离出来的单个细胞中，只有40%带有这种病毒。通过植物个部位器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。4.茎尖微体嫁接对茎尖培养难于生根的植物，可进行试管茎尖微体嫁接。方法：（1）砧木种子表面消毒，接于培养基发芽；（2）约2周的幼嫩实生苗无菌条件下切取顶部，留1-1.5cm上胚轴部分，除去子叶一小段新梢，消毒后取出仅带1-3个叶原基的茎尖约1mm大小作接穗；（4）倒T字形嫁接（5）液体滤纸桥培养5.茎尖微体嫁接对茎尖培养难于生根的植物，可进行试管茎尖微体嫁接。方法：（1）砧木种子表面消毒，接于培养基发芽；（2）约2周的幼嫩实生苗无菌条件下切取顶部，留1-1.5cm上胚轴部分，除去子叶一小段新梢，消毒后取出仅带1-3个叶原基的茎尖约1mm大小作接穗；（4）倒T字形嫁接（5）液体滤纸桥培养InvitromicrograftingofshoottipsofCitrussinensisona2-week-oldTroyercitrangerootstock.aFreshgraft.bLongitudinalsection5daysaftergrafting,showingcallusformationatthegraftunion.5.冷冻疗法Cryotherapyisanovelapplicationofplantcryopreservationtechniquestoeradicatepathogens,suchasviruses,phytoplasmasandbacteria,atahighfrequencybyabriefexposureofshoottipstoliquidnitrogenusingcryopreservationprotocols.Combinationofthermotherapyandcryotherapyfortheeliminationofvirusesthatinvadetheshootmeristemcells.三、脱毒苗的鉴定1.指示植物法利用病毒在其它植物上产生枯斑和空斑的现象作为鉴别病毒种类的标准，这种专门用来产生局部病斑的寄主叫指示植物。以指示植物做砧木，以被鉴定植物作接穗进行嫁接鉴定。2.抗血清鉴定法植物病毒是一种很好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗原和抗体的结合即为血清反应。抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中，故含有抗体的血清即称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，因此用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类。3.电子显微镜检查法病毒制品切成约20nm厚的薄片，置于铜载网上，在电子显微镜下观察。Schematicrepresentationofviruseradicationprocessinpotato.Asepticplantletsareestablishedfromnodalsegments(c)ortuberpieces(a)andmicropropagated(d,e).Theparentplant(b)ortheinvitro–raisedplants(d,e)aresubjectedtothermotherapy,and0.2-mmmeristem-tips(f)areexcisedfromthemandcultured.Theplantsderivedfromthesemeristemsbefore(g,h)andafter(i)transfertogreenhouseareindexedforvirusesandviroids.应用举例（一）茎尖脱毒与组培取材与消毒•品种选好后，在生长季节选择典型植株，收获薯块，播于室内砂床育芽，芽长4～5厘米，剪取2～3厘米的壮芽，剥去易见叶片，放在自来水下冲洗１小时左右，在无菌室里用0.1%的升汞或70%酒精消毒１分钟，立即用5%漂白粉或次氯酸钠浸泡5～10分钟，再用无菌水冲洗3次，放入培养器内。茎尖剥离和接种•在无菌室内，把消毒好的芽放在解剖镜下进行仔细剥离，用解剖刀仔细切取0.1～0.2毫米的茎尖生长点，然后，迅速接种到预先作好的培养基上。组织培养•把生长点放入培养基后，培养试管放入温度20～25℃，光照强度1000～3000lx等条件下培养。切段快繁•由茎尖培养成的小植株长出5片叶子时，进行第一次切段繁殖，把每段只带一个叶片的小茎接种到MS或MA培养基上。25天左右又可进行第二次分段繁殖。繁殖出一定数量后（20株左右）。分出一部分进行病毒鉴定。另一部分低温保存，待病毒鉴定后决定取舍和切段繁殖进行培养。微型薯工厂化生产•当组培苗长出4～5片叶子后，把脱毒苗扦插在无土机质上，在一定的温、湿、光照条件下，浇施营养液生产脱毒小块茎。用工厂化生产方法生产微型小薯，不仅降低成本，而且不受季节，地理环境限制，一年四季均可大批量、短周期规模化生产微型小薯，从而满足大面积应用脱毒薯种源的需要，这样的微型脱毒小薯，单薯重2克左右，每亩只需8～10公斤。栽培和繁苗。•把试管中的脱毒苗取出清洗扦插在以蛭石为主的无菌基质上，约经20天待成活后再剪切芽顶，用生根液处理后扦插，从而扩大繁殖倍数，降低成本。栽培管理。•扦插苗成活后，开始浇营养液，在温度19.4℃左右、77%以下湿度，2万lx光照强度下培养，并浇施营养液。当地下部70%以上植株所结薯达到2克左右时开始收获。（二）草莓脱毒繁苗1、脱毒苗的提出壮苗体内有较多的营养积累，根系发达，定植大田后能很快缓苗生长，形成健壮草莓植株并分化出较多花芽，为翌年丰产奠定基础。草莓育苗阶段正值外界环境温度较高、雨水较多的时候，为培育壮苗带来一定难度。由于母株是按生产田的要求移栽的，密度大，又经过大量结果，母株已很虚弱，发根力低下，故抽生的匍匐茎少，长出的匍匐茎苗必然细弱，定植后产量不高。再加上前茬留下的大量枯茎落叶烂果，是病害的病原残体，尤其是病毒的危害一般为30%。草莓几乎都受病毒的感染。我国草莓主要品种已受到草莓班驳病病毒（SMOV）、草莓和性黄边病毒（SMYEV）、草莓镶脉病毒（SVBV）、草莓皱缩病毒（SCrV）等病毒感染。无病毒苗植株生长旺盛，成活率高，平均增产20%-30%。繁殖速度快，一年内一个分生组织可获得几万到几十万株优质苗。因此采用无毒苗是国内外草莓生产的主要趋势。2.茎尖培养取材茎尖分生组织作为外植体，在小于0.3毫米的情况下可以得到脱毒的秧苗。取材时间以每年6-8月匍匐茎生长充实、尖端生长良好时为宜。取材以匍匐茎尖或子苗均可。材料取回后，用手剥去秧苗外叶，如为匍匐茎尖则可直接在自来水龙头下冲洗2-4小时或更长时间，然后将试材进行表面消毒。消毒茎尖消毒可采用下述两种方法：（