流式细胞术及其临床应用

流式细胞仪(FlowCytometer)是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器；当细胞（或其他粒子）以单个方式依次通过探测光束时，能够采集细胞被光照时产生的各种信号，然后对信号进行处理，并能对多个参数进行关联分析的一种仪器流式细胞术(FlowCytometry，FCM)利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术流式细胞术流式细胞术激光技术、计算机技术、显微荧光技术、光电子技术、流体喷射技术、单克隆抗体技术、纳米技术以及分子生物学和免疫学等多门学科知识现代科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体的“大成者”广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科领域20世纪70年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由基础研究进入到临床检验医学领域，为细胞分析提供全新手段1930Caspersson&Thorell细胞计数1940Coons结合荧光素的抗体去标记细胞内特定蛋白1934Moldaven细胞检测自动化光电仪记录流过一根毛细管的细胞数1949WallaceCoulter悬液中计数粒子的方法并获专利1950Caspersson显微分光光度计UV-VIS光谱区检测细胞1953CroslanndTaylor根据分层鞘流原理成功设计红细胞光学自动计数器1969VanDilla及同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计1972Herzenberg荧光激活细胞分选仪荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号1975Kohler单克隆抗体为细胞研究提供大量的特异免疫试剂流式细胞术发展史1973BD公司与斯坦福大学合作第一台商用流式细胞仪分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选流式细胞仪的分类计算机与分析系统信号收集与光电转换系统流动室与液流系统光源与光学系统流式细胞仪构造激发光源计算机分析滤光片流动室、鞘液和样本流信号检测器激发光源光学系统细胞分选与浓缩系统（一）流动室与液流系统流动室是流式仪核心部件，被测样品在此与激光相交流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息（一）流动室与液流系统液流驱动系统（二）激光光源与光学系统（一）激发光源：激光器气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有Rhodomin6G水溶液染料，发出550-650nm可变波长激发光；半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长；BD的FACSCalibur已采用635nm半导体激光器激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照（二）激光光源与光学系统（二）光束成行系统（二）激光光源与光学系统透镜（二）光束成行系统滤光片的组成长通(Longpass，LP)滤片：只允许特定波长以上的光束通过短通(Shortpass，SP)滤片：只允许特定波长以下的光束通过带通(Bandpass，BP)滤片：只允许一定波长范围内的光束通过（二）激光光源与光学系统（三）光收集系统（二）激光光源与光学系统480520460500540SP500LP500BP500/50（三）光收集系统480520460500540480520460500540光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数前向散射光(forwardscatter,FSC)侧向散射光(sidescatter,SSC)荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍（三）信号收集和光电转换系统（一）前向散射光FSCFSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小（三）信号收集和光电转换系统（二）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）信号收集和光电转换系统R1:淋巴细胞R2:单核细胞R3:中性粒细胞R4:裂解碎片（三）信号收集和光电转换系统外周血裂红后FSC/SSC分布（三）荧光信号荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光（三）信号收集和光电转换系统基态（三）荧光信号细胞经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测就能了解所研究细胞参数的存在与定量细胞抗原抗体荧光素激光束（三）信号收集和光电转换系统（三）荧光信号常用荧光素（三）信号收集和光电转换系统荧光素分子激发波长(nm)发射光波(nm)中文名FITC488525异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白PerCP488677多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物APC633/635660别藻蓝蛋白PE-Cy5488670藻红蛋白-花青素5PE-Cy7488755藻红蛋白-花青素7PerCP-Cy5.5488710能量传递染料（三）荧光信号常用荧光素（三）信号收集和光电转换系统能量传递染料(PE-Cy5PE-Cy7PerCp-Cy5.5)用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生荧光信号，最终检测第二荧光染料发射的特定荧光信号（三）荧光信号（三）信号收集和光电转换系统499nm：蓝色荧光（Blue）500-549nm：绿色荧光（Green）550-584nm：黄色荧光（Yellow）585-615nm：橙色荧光（Orange）616-700nm：红色荧光（Red）≥700nm：远红外荧光（Far-Red）（三）荧光信号（三）信号收集和光电转换系统目前常用FCM配置（BDCalibar）488nm激光管常用染料有第一通道（FL1）：FITC(FluoresceinIsothiocyanate)第二通道（FL2）：PE(Phycorey-thrin)第三通道（FL3）：PerCP(PeridininChlorophyllProtein)PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5633nm激光管常用染料有第四通道（FL4）：APC多色标记荧光素搭配原则每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APCFL-AFL-HFL-W面积（A）：荧光总量高度（H）：最大荧光强度宽度（W）：细胞直径光信号到电脉冲信号FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统（四）计算机和分析系统FCM数据显示方式单参数直方图(Histogram)双参数数据显示：散点图(DotPlot)伪彩图(Pseudo-colorPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(DensityPlot)假三维图(Pseudo3DPlot)三维图(3DPlot)常用分析软件–CellQuest–Diva–FlowJO–WinMDI–FCSExpress直方图（Histogram）细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数Event#FL1FITC11027003720415……0…………101…………102…………103CountsFITC荧光强度（四）计算机和分析系统直方图（Histogram）（四）计算机和分析系统横坐标既可以是线性的，也可以是对数的DNA倍体分析抗原表达分析Overlay图散点图(DotPlot)（四）计算机和分析系统散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观FL1FL2散点图(DotPlot)（四）计算机和分析系统散点图伪彩图等高图和等密度图（四）计算机和分析系统等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。（四）计算机和分析系统假三维图和三维图CountsSSC→门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程椭圆形圆形设门与数据分析（四）计算机和分析系统矩形任意形状R(Region，区域)：门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2（四）计算机和分析系统十字门线性门（四）计算机和分析系统流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞仪特点目前国内主要流式细胞仪厂家BecktonDickinson(BD)BACKMANCOULTEREpicsXL单激光四色，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500单激光或双激光五色，市场覆盖率较高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分选型BeckmanCoulter公司流式细胞仪BD公司分析型流式细胞仪FACSCalibur双激光四色，市场覆盖率最高FACSCantoII双激光六色，三激光八色FACSVerse双激光六色，三激光八色AccuriC6双激光四色BD公司分析型流式细胞仪LSRFortessa™X-20五激光十八色，分析型最高配LSRII双激光六色，三激光八色，四激光十色FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBD公司分选型流式细胞仪BDFACSCantoII双激光或三激光，8色分析八角形/三角形光信号接受系统，利用全反射的光路结构设计，避免透射过程对光信号的损耗，提高荧光灵敏度兼顾科研需求和临床检测BDFACSTM7-colorsetupbeads使体外诊断中所有实验的日常仪器设置在一管中进行专门配备有FACSCanto临床软件，淋巴细胞亚群，HLA-B27等临床自动检测和分析软件，直接报告检测结果独立液流车系统，保持液流的稳定最小样本量：30微升手动上样/自动连续上样获得SFDA认证BDLSRFortessa™X-20提供5激光，18色分析18种波长的激光器，横跨从紫外到红外全光谱范围，提供灵活的光谱选择满足高端科研需求淋巴细胞亚群HLA-B27CD55、CD59检测CD34造血干细胞计数白血病和淋巴瘤免疫分型TH1/TH2细胞检测血小板活化炎症感染指标CD64网织红细胞/血小板检测微小残留病灶（MRD）肿瘤细胞倍体（DNA）细胞凋亡……流式细胞术的临床应用标本的种类：血液、骨髓穿刺液、各种体液（胸水、腹水、脑脊液）、组织（如淋巴结、肝、脾）及肺泡灌洗液等抗凝剂：外周血：EDTA、肝素和枸橼酸均可骨髓：肝素（推荐）、EDTA血小板：枸橼酸储存时间：EDTA：24～48h肝素：48～72h枸橼酸：72h严重溶血、凝血或坏死的样本应弃用单细胞悬液标本要求淋巴细胞亚群分析试剂：BDMultitestIMKKit标本：外周血（常用）配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APCCD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC检测指标：T细胞（CD3+CD4+、CD3+CD8-）B细胞（CD19）NK细胞（CD3-CD16＋56＋）临床意义——反应体内免疫状态CD4+T降低：病毒感染、恶性肿瘤、免疫缺陷病、免疫抑制剂使用CD8+T增高：病毒及结核杆菌感染，自身免疫性疾病活动期、肿瘤、慢性活动性肝炎CD4/CD8降低：处于免疫抑制状态