流式细胞术常见实验分析

——四种常见流式实验讲解林奕婷2013年8月14日1.Guavaeasycyte8HT操作流程2.四种常见流式细胞术细胞凋亡的检测与分析DNA含量检测与细胞周期分析胞内活性氧水平的检测与分析细胞表面分子的检测与分析组合实验1.Guavaeasycyte8HT操作流程——Incyte模块1.1开机-清洗（原则：先开仪器后开软件，开机必清洗）1.2采集样本1.3分析1.4关机（原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗）1.5日常维护1.1清洗1.2样本采集editWL•1.3分析见具体实验的分析。•1.4关机1.5日常维护保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。桌面不要有震动，以免光路发生偏移。上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，流式专用的物品请不要带走。做完请记得登记。每周在周一进行一次easycheck。（自己在做实验之前也可进行easycheck，流程见下面。）微珠：10μL（用前震荡混匀）Buffer：190μLeasycheck2.四种常见流式细胞术2.1细胞凋亡的检测与分析2.1.1PI单染法2.1.2Annexin-Ⅴ-PI双染法2.1.3线粒体膜电位法凋亡启动凋亡早期凋亡晚期2.1.1PI单染法•正常细胞DNA含量：2n~4n•凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）。基本原理：操作方法与结果分析见细胞周期部分。优缺点：•优点：简便，快捷，价廉，应用普遍。•缺点：2.1.2Annexin-Ⅴ-PI双染法基本原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜。正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ-凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-结果分析阴性对照PIPI/AnnexinⅤ-FITCAnnexinⅤ-FITC荧光交叠荧光补偿原理荧光补偿AnnexinⅤ-FITC单染优缺点：2.1.3线粒体膜电位法基本原理：---++++++488nm590nm正常细胞线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1：亲脂性阳离子荧光染料，特异性地与线粒体内膜结合，膜电位高时呈聚合体，膜电位低时呈单体。凋亡细胞-++488nm529nm结果分析用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体）和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色荧光与黄色荧光阳性百分率之比。Ratio=G.M./Y.M.比值升高，膜电位降低，膜受损。2.2DNA含量检测与周期分析2.2.1DNA倍体分析——PI染色法2.2.2S期特异性检测2.2.3M期特异性检测2.2.1DNA倍体分析——PI染色法细胞周期与DNA含量变化极其FCM分析直方图基本原理：结果分析——Guava原软件分析Red-ARed-WRed-WRed-AHAW在用第三方软件分析之前，请将流式结果按如下所示导出。结果分析——Modfit软件分析结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C结果分析——Flowjo软件分析2.2.2S期特异性检测S期DNA合成期，S期的比例增多往往与细胞分裂的活跃程度相关。传统的PI染色可以通过DNA的倍增区分G1期与G2/M期。S期则因界限不明显，难以区分。若需要准确的统计S期的变化，需要加入S期的特异性标志，即BrdU。BrdU只在DNA合成时被掺入核酸，是指示DNA复制的金标准。因此可通过BrdU-AlexFluor®488与PI复染将S期准确的区分开来。2.2.3M期特异性检测G2期是指DNA合成后期，M期是细胞分裂期。二者在细胞周期事件中所处的时项不同，所表示的生物学意义也大不相同。准确检测M期的变化对细胞增殖、凋亡及癌症的研究相当重要。M期的检测标志是丝氨酸磷酸化组蛋白H3(pH3)。当细胞周期从G2期转换到M期时，染色质上的组蛋白H3Ser10发生磷酸化，并在有丝分裂后快速的去磷酸化。由此组蛋白H3的丝氨酸磷酸化变化将停留在G2期的细胞与M期的分裂细胞区分开来。2.3胞内活性氧水平的检测与分析DCFH-DA单染法DCFH-DADCFHROSDCFDCFH-DA进入细胞在细胞内酯酶作用下脱去二脂形成不发荧光的DCFH，当细胞内存在H2O2，O2-，OH-等ROS时被氧化成发绿色荧光的DCF。注意事项：（1）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显结果分析——数据分析中几种常见图形及分析原则分析原则：根据阴性对照界定阴性置信区；允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）一般小于1%~5%；可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。（2）样本管与阴性对照管峰形重叠样本管峰形左侧右移，右侧有肩峰，弱阳性的样本常出现此类图形。分析原则：根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区应设在两曲线分离处；可记录阳性细胞百分率（近似值）或平均荧光强度或弱阳性；允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）高些，但阳性细胞百分率（近似值）应减去假阳性率。样本管峰形整体右移。在排除非特异性染色的情况下（如设置严格的对照、调节抗体浓度等），方能进行分析。分析原则：不可根据阴性对照界定阴性置信区；可记录平均荧光强度，不可记录阳性细胞百分率。（3）同时出现弱阳性峰与强阳性峰的组合图形分析原则：根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区可设在两曲线分离处。阳性细胞既含弱阳性细胞又含强阳性细胞，但阳性细胞百分率应减去假阳性率；界定先可设在弱阳性返回基线处，阳性细胞仅表示强阳性细胞；可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。2.4细胞表面分子的检测与分析2.4.1免疫学检测2.4.2干细胞分析2.4.1免疫学检测数据分析2.4.2肿瘤干细胞分析MCF-7negativecontrolMCF-7CD24MCF-7CD44MCF-7CD24/CD440.08%0.03%89.8%5.35%侧群细胞•细胞周期特异性凋亡检测：AnnexinⅤ染色后用透膜固定剂固定，然后加入PI进行DNA染色。2.5组合实验•报告基因与细胞周期结合•报告基因与细胞凋亡结合GPF-GFP+Total•ROS与细胞活性结合——DCFH/PI染色法•干细胞分析与细胞活性结合——表面标志物抗体/PI染色法