酶活性测定的主要影响因素及控制

酶活性浓度测定的主要影响因素及控制酶（enzyme）酶的应用临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。酶的概念是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质，又称为生物催化剂。酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者为主。酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。酶活性浓度的测定受许多因素的影响。酶活性浓度测定的主要影响因素1.标本及标本采集和处理因素2.试剂及方法学因素3.仪器因素的影响4.测定条件与参数设置1.标本及标本采集和处理因素的影响及控制1.标本及采集和处理的影响因素1.1溶血1.2抗凝剂1.3温度1.4空气与光线1.5标本副反应1.6酶蛋白浓度1.7其他1.1溶血最重要的影响是RBC内酶的大量释出。大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性远高于血清；如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高100、15和7倍左右。RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的测定。1.1Hb的吸光度曲线1.1溶血影响的控制减少溶血体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加以克服；分清体内溶血与体外溶血。减少溶血的干扰可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连续监测法以及改进商品试剂等措施，克服对分光光度分析的影响。应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。1.1注意:RBC中酶的干扰不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以，静脉采血后，必须在1～2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免引起误差。1.2抗凝剂临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属离子螯合剂；在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子，Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）的激活剂。1.2肝素是一种粘多糖，是对酶活性影响最小的抗凝剂，对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响，适于急诊时迅速分离血浆进行测定。1.3温度由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、-GT和ALP等）可在室温保存1～3天活性不受影响。有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50%。1.3贮存不同室温体液酶的稳定性（活性变化小于10%）酶室温（25℃）冷藏（0～4℃）冰冻（-25℃）LD1周1～3d§1～3d§-GT2d1周1月ALD2d2d不稳定*ALT2d5d不稳定*AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2～3d2～3d1月ACP4h※3d#3d#5’-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周*酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH51.3温度影响的控制及时检测低温贮存大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测定时，应在血清分离后置冰箱中冷藏。1.4空气与光线血清置于空气中时，血中CO2丧失极快，pH可在15min内由7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感的ACP活性迅速下降。某些酶易受光线破坏，CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆地失活，其失活程度与暴光时间的长短成正比。1.5副反应副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶测定的反应。NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一致的。若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。1.5副反应(酶偶联法测ALT)由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。ALT活性测定的反应式如下：丙酮酸谷氨酸氧代戊二酸丙氨酸LLLALT2NADLHNADHLLD乳酸丙酮酸1.5副反应的控制可通过加入副反应抑制剂，或对样品进行预处理等方法给予排除。双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时间是最经济的方法。1.6酶蛋白浓度酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易解离、易吸附于容器上和易发生表面变性之故。酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超过检测仪器的线性范围时，需将样品进行稀释或减少样品用量后再行测定。样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与抑制剂被稀释有关。1.7其他样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。季节冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长，可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬季测定LD的活性较夏季高。2.试剂及方法学因素的影响及控制2.试剂及方法学的影响因素酶的测定大多使用商品试剂盒不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技术含量等常有区别。常见的影响因素2.1定时法与连续监测法2.2检测底物或检测产物2.3底物启动模式与样品启动模式2.4正向反应与逆向反应2.5试剂的干扰作用2.影响因素的控制选购试剂盒时要仔细阅读试剂盒说明书；了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等；选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方法，或选择公认的测定方法。使用时定期对试剂盒的质量进行监测；准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽；正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。2.酶活性测定的原理酶活性与速度的关系*酶促反应进程曲线2.1定时法与连续监测法的选用在条件许可的情况下，应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。连续监测法可以选择线性期的反应速度来计算酶活性，测定结果可靠，是首选的方法。但该方法仪器要求相对较高。在基层单位，某些酶采用定时法测定也可以得到比较准确的结果。ALP酶活性的测定，如加做样品空白，两法的结果准确性相当。2.1连续监测法与定时法的酶促反应时间进程曲线2.2检测底物或检测产物的选择取决于哪个更方便，测定的结果更准确。通常原则是选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。反应时底物浓度高，反应时间短；这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之一。除部分测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外，已很少采用测定底物消耗量的项目。2.2检测底物或检测产物的选择底物与产物举例ALT测定（赖氏法-定时法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸+L-谷氨酸α-丙酮酸+2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙(红棕色，λ=505nm)ALT测定（连续监测法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸+L-谷氨酸NADLHNADHLLD乳酸丙酮酸ALT碱性条件下ALT2.3底物启动模式与样品启动模式底物启动模式（IFCC推荐采用）。指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样品中的待测酶的酶促反应。好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。这种模式需要双试剂剂型。样品启动模式。指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应；只是在延滞期去除部分干扰物。这种模式可采用单一试剂剂型。2.3底物启动模式与样品启动模式双试剂与单试剂酶促反应时间进程曲线2.3需要注意某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。2.4正向反应与逆向反应一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。除原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向外，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。例如，CK的测定普遍采用逆向反应，因其逆向反应是正向反应的6倍，而且受影响因素少。2.4正向反应与逆向反应LDH测定的选择目前尚有争议。国内多采用正向反应（L→P），与IFCC在2001年发表的操作手册一致。正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低廉，稳定性好。国外常用方法曾是逆向反应（P→L），反应速度是正向的3倍，成本也较低。HNADHNADLLD丙酮酸乳酸NADLHNADHLLD乳酸丙酮酸2.5检测试剂的干扰作用试剂酶的污染。组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。底物的非酶反应。很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。如碱性磷酸酶（ALP）测定解决的方法是通过试剂空白管检出并加以校正。选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量好的试剂。3.仪器因素的影响及控制3仪器的影响因素加样系统加样的准确性、重复性和携带污染；反应系统反应杯的形状、表面和携带污染；反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围；搅拌和清洗机构的效果和携带污染；检测系统光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等均会造成结果的偏差。3仪器影响因素的控制在日常工作中，除常规做好仪器和设备的正确使用和维护外，重点应注意仪器的校准问题。3.1酶活性浓度的计算公式摩尔吸光系数和系数K均为常数，和K受仪器诸多因素的影响，如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。和K可用校准物定期校正。KALUmin/LvVK6103.2校准物可用作酶活性测定用的校准物分两类。一类是产物的基准物质，如对硝基酚、对硝基苯胺等，用于校准仪器的值（摩尔吸光系数）。另一类称酶校准物（Enzymecalibrator），多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近，用于校准仪器的K值（酶活性浓度定量系数）。3.2校准物国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。3.3ε的校准（340nm波长）NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。在340nm的NAD(P)H的，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的。NAD(P)H的ε为6220。如果6000ε6600为不合格，则需找维修部检查。注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。3.3ε的校准（405nm波长）最常用的色素原为对硝基苯酚等。对硝基苯酚在405nm的，可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算ε值。对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大，则需找维修部检查。3.4K的校准（公式计算法）将上述实测ε值代入K值计算公式得到校准K值外。LvVK6103.4K的校准（酶校准物）使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。使用酶校准物的优点，除具有实测ε值换算出的校准K值所具有的一切优点外，还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。3.4K的校准（频率）最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准：试剂盒改变厂家，或者更换了批号；仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件；质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规