酶的分离纯化

第二章酶的分离纯化知识点:1.酶活性测定2.酶溶液制备3.酶分离纯化的基本过程4.根据分子大小轻重建立的分离纯化方法5.调节溶解度的分离方法6.按电荷的正负性设计的分离方法7.根据亲和作用建立的纯化方法8.根据稳定性的差异建立的分离纯化方法9.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法学习目标和要求:1.掌握酶活性测定和酶溶液制备方法.2.掌握根据分子大小轻重建立的分离纯化方法和按电荷的正负性设计的分离方法及.根据亲和作用建立的纯化方法3.熟悉酶分离纯化的基本过程4.了解调节溶解度的分离方法、根据亲和作用建立的纯化方法、.根据稳定性的差异建立的分离纯化方法及.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法酶的分离提纯包括三个基本环节：一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:(1)要注意防止酶的变性失活.(2)酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。(3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。1酶活性测定酶活力(EnzymeActivity)也称酶活性，履指酶催化一定化学反应的能力.酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度(指初速度)可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示.其单位为mol/s。1.1酶的活力单位1.2摩尔催化活性\分子活性和转化率(催化中心活力)mol催化活性(MolarCatalyticActivity)表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：Vmax=Ko[E]Ko=Vmax/[E]Ko即为转换率(也用Kcat表示),如果每一个酶分子只有一个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n.每种酶的转换率不同.下表列出了几种酶的转换率:1.3比活力比活力(性)(SpecificActivity)是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯.1.4酶活力的测定方法酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。1.4.1终止反应法(StoppedMethod)终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用SDS）使酶失活或加热使酶变性等。（1）酶法酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H202的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度的影响再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-P+NADP+→6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性.酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行.(2)化学法化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性.化学分析法的优点是:不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新的评价。（3）放射性化学法是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性.优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。1.4.2连续反应法(ContinuousMethod)连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。（1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。下表即是几种连续法的例子：（2）偶联的连续法是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。如醛缩酶(Aldolase)催化1，6—二磷酸果糖生成3-P—甘油醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出.用磷酸丙糖异构酶(TriosePhosphatelsomerase))来作偶联酶(CouplingEnzyme)，甘油—1—P—脱氢酶(Glycerol-1-PhosphateDehydrogenase)来作指示酶依据NNADH变成NAD+的光谱变化来算出醛缩酶活性。如下图：醛缩酶以l—P—甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法1.4.3酶活力测定中应注意的几个问题酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的—些特点。首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比.初速度的确定一般指：底物消耗量在5％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的速度。其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和)，否则，底物浓度本身是—个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。第三，反应必须在酶的最适条件(如最适温度、PH和离子强度等)下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度(E)作图，应得一条通过原点的直线，即v为（E）的线性函数。初速度的确定是在底物浓度([S])足够的条件下，通过[E]的变化来确定如下图.由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化.求得几个适当时间的反应速度(反应量／反应时间)。再用反应速度对酶量作图。由图可见．其中，5min时测得的数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏低。1.4.4酶活性测定实例(1)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶,催化反应为:O2·﹣+O2·﹣+2H+→H2O2+O2由于O2·﹣在溶液中极不稳定,给酶活性测定带来许多不便.目前已有根据O2·﹣的物理性质测定O2·﹣的歧化量,从而直接测定SOD活力的方法.如电子顺磁共振波谱法(ESR)、核磁共振法（NMR）、紫外分光光度法等，这里只介绍化学法测定酶活力。以邻苯三酚法为例：邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴离子自由基可通过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定的实验条件下（见操作），抑制率达到50%时的SOD的浓度为1个酶单位。操作方法：在试管中加入pH8.2的50mmol/LTris-HCl缓冲液4.5ml，于25℃保温20min，然后加入预热的45mmol/L连苯三酚溶液（对照管用10mol/LHCl代替）10μl，迅速迅速摇匀倒入1cm比色杯，每隔30s在325nm处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在0.070OD/min。测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同的仅是在加入缓冲液后再加入10μl待测样品即可。酶活力计算方法：单位体积活力（u/ml）=｛（[（0.07—样品速率）/0.07]×100%）/50%｝×反应液总体积×（反应液稀释倍数/样液体积）总活力=单位体积活力（u/ml）×原液总体积用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加入量只有10ul，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按4.5计算。(2)糖苷酶的活力测定糖苷酶的活力测定多用人工底物,如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶的作用下,糖苷键断裂,产生等当量的糖和对硝基苯酚.对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收.从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的活性.操作:试管中加入5mmol/L对硝基苯基糖苷200ul,pH4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸配制的缓冲液200ul,37℃预保温10min,再加入χul待测样品并用水补足到100ul,37℃反应15min,用0.5mol/LNa2CO31ml终止反应9注意空白管用水代替对硝基苯基糖苷和待测样品),在400nm处测定A值.酶单位定义为在上述测定条件下每分钟释放1umol对硝基苯酚的量为1个单位的酶,对照标准曲线,即可计算处酶活力.2酶溶液制备酶溶液制备包括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液的浓缩。2.1材料预处理及破碎细胞酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：—是释放到细胞外的酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内的酶．叫溶酶；三是牢固与膜或细胞颗粒结合在—起的，叫结酶，后二者合称胞内酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差异。微生物胞外酶，用盐析，或单宁沉淀.有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶需收集菌体，经破细胞后提取，其中结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合的问题。动植物细胞，也有打破细胞的问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪组织等；对植物材料如种子应去壳．以免单宁等物质着色污染。进行预处理后，就是破碎细胞。细胞破碎有物理和化学方法两大类:2.1.1物理粉碎法(1)研磨手磨法是实验室内常用的方法。用石英砂或氧化铝作助磨剂来制备无细胞抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择坚硬的石磨，装上动力研磨。细菌磨也是在实验室中使用较好的方法。(2)机械捣碎匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎.(3)高压法在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在2—15℃下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。(4)爆破性减压法将菌体悬浮在N2／C02高压下平衡，37℃振荡数分钟，然后突然