酶的提取和分离纯化

Chapter3TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的提取与分离纯化补充：发酵液的预处理——固液分离（1）菌种（2）培养基（3）无机离子的去除（4）杂蛋白质的去除（5）色素及其他物质的去除主要方法是离心分离和过滤Contentsofchapter31、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取(重点)4、酶的分离方法(重点)5、酶的组合分离纯化策略6、酶的浓缩、干燥与结晶3.1酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取动物、植物或微生物细胞酶分离纯化酶浓缩酶贮存发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。3.2细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。(1)机械破碎(2)物理破碎(3)化学破碎(4)酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与组成细胞破碎方法及其原理机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：表面活性剂酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞声波机械渗透压温度差动植物++++++++++++革兰氏阴性菌++++++++革兰氏阳性芽孢菌++++++酵母++++革兰氏阳性球菌+-++菌丝-++-++孢子----细胞对破碎方法的敏感性3.3酶的提取定义指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。目标将目的酶最大限度地溶解出来保持生物活性原则根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。3.3酶的提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L盐溶液提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6水溶液提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12水溶液提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取与水混溶的有机溶剂提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。3.3酶的提取影响因素主要影响因素：酶在所使用的溶剂中的溶解度酶向溶剂相中扩散速度另外：温度-适当提高温度pH值-避开酶的等电点提取液体积-为原料体积的3～5倍，分几次提取适当搅拌、适当延长提取时间、适当加入保护剂3.4酶的分离方法3.4.1沉淀分离3.4.2离心分离3.4.3过滤与膜分离3.4.4层析分离3.4.5电泳分离3.4.6萃取分离3.4.1沉淀分离定义是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。分离降低酶的溶解度酶、杂质改变条件、添加物质3.4.1沉淀分离机理沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀等电点沉淀法两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出有机溶剂沉淀法酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶3.4.1沉淀分离盐析沉淀法盐浓度（中性盐）离子强度饱和度温度-室温pH-欲分离酶的等电点Ks分段盐析、β分段盐析3.4.1沉淀分离等电点沉淀法等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。在加酸或加碱调节pH值的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。3.4.1沉淀分离有机溶剂沉淀法有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇用量一般为酶液体积的2倍左右分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。3.4.1沉淀分离复合沉淀法常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。选择性变性沉淀法加热、改变pH值、加进某些金属离子，使杂蛋白变性沉淀除去。对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类，含量及其物化性质有比较全面的了解。3.4.2离心分离定义是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。依据要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。1、离心机常速离心机（低速离心机）最大转速8000r/min，相对离心力（RCF）1×104g以下用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机最大转速（1～2.5）×104r/min，RCF1×104～105g用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。高速冷冻离心机超速离心机最大转速(2.5～12)×104r/min，RCF5×105g甚至更高。用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。2、离心方法常速离心机和高速离心机由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果；如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。超速离心根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。3、离心条件离心力（或离心速度）低速离心一般可以用离心速度，即转子每分钟的转数表示。高速离心，特别是超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示。离心时间沉降时间温度和pH值离心温度一般控制在4℃左右pH值必须是处于酶稳定的pH值范围内，必要时可以采用缓冲溶液。3.4.3过滤与膜分离定义是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。介质滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质3.4.3过滤与膜分离过滤的分类及其特性-根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子超滤膜反渗透20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜3.4.3过滤与膜分离膜分离技术定义：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术介质：丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物膜分离加压膜分离微滤、超滤、反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析补充1：四种常用膜分离技术的基本特征补充2：四种常用膜分离过程的截留特性3.4.4层析分离（色谱技术）定义是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中。其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。3.4.4层析分离基本原理：3.4.4层析分离方法：层析方法分离依据吸附层析吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离1、吸附层析定义利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。1、吸附层析洗脱方法溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法过程层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。2、分配层析定义利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数——一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。固定相——一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂。流动相——另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动。2、分配层析过程当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。类型纸上层析分配薄层层析3、离子交换层析定义是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。3、离子交换层析类型离子交换剂(活性基团的性质)阳离子交换剂阴离子交换剂由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。4、凝胶层析（凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析）定义指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。4、凝胶层析过程混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。常用的凝胶：葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶5、亲和层析定义是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。原理5、亲和层析5、亲和层析类型根据欲分离组分与配基的结合特性,可分为：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析3.4.5电泳分离定义带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。影响因素移动速度本身所带的净电荷量颗粒形状和颗粒大小电场强度溶液pH值离子强度支持体的特性3.4.5电泳分离类型按其使用的支持体的不同，可以分为：纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳等电聚焦电泳3.4.6萃取分离定义是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相，有时也可采用其它流体。3.4.6萃取分离类型按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取双水相萃取超临界萃取纯化方案的设计纯化方法的选择依据——根据有效成分和杂质之间理化性质的差异纯化方法的排序——先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。3.5酶的组合分离纯化策略3.5酶的分离方法注意（1）各种酶的纯化方法都有其固有的优缺点在设计某一酶的纯化线路时，应考虑各种因素对选用的纯化方法及先后次序的影响。（2）初步纯化（roughfractionation）除去与目的产物性质差异很大的杂质。（3）高度纯化（finefractionation）（精制）除去与产物性质相似的杂质。(1)粗酶:采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。纯度1%(2)部分纯化:初步的纯化，使用各钟色谱层析法。纯度50%-90%(3)均质酶蛋白:目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPL