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ChapterthreeTechniquesofgeneticengineeringChapterthreeAnalysisofDNAsequenceSectionfourChapterthree一.化学法(Chemicalsequencing)1977年Maxam和Gilbert建立，是唯一能直接应用于双链DNA测序的方法。用此法测定SV40为5226bpChapterthree1.原理：用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基A，T，G，C处的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。Chapterthree2.化学切割反应的试剂与方法：肼（hydrazine）：又叫联氨（NH2.NH2），T+C反应：在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片断上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。C反应：盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶（C）碱基特异的切割反应。由此来区别C和C+T这两种化学反应。Chapterthree硫酸二甲酯（dimethylsulphate）：G反应：硫酸二甲酯能使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，pH中性条件下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。G＋A反应：酸性条件下，如甲酸处理，可使G和A嘌呤环上的N原子质子化，糖苷键稳定性下降，利用六氢吡啶（哌啶）使嘌呤碱基脱落，DNA从G和A处断裂。由此来区别G和G+A这两种化学反应。ChapterthreeChapterthreeChapterthree二、Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长。ChapterthreeDNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。例如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP(其中一种为α-32P标记)的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。Chapterthree经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3'端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。ChapterthreeChapterthreedNTP/ddNTP=1:100，ChapterthreeChapterthreeSanger双脱氧-pUC体系pUC是一种质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。Chapterthree四色荧光法测序：用四中颜色的荧光标记物分别标记四个反应的中止碱基，反应分别进行，电泳在一个泳道内完成，胶可以将片断逐一分离，然后用激光器诱发荧光，同时对胶进行扫描，进行测序分析。Chapterthree