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1基因工程试卷B一.名词解释(每个2分,共20分)1,转化:质粒重组DNA分子通过与膜蛋白结合而进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。2,质粒转移性:在自然条件下，许多质粒能通过细胞结合的作用转移到新宿主细胞中。3,DNA文库:由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。4,RACE:是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术5,选择标记基因:6,降落PCR：7,载体:将外源DNA或者基因携带入宿主细胞中的工具。8,感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后，引起细胞膜的通过性改变，成为能容许外源DNA载体分子通过的细胞。9，CaMV35s:10,ORF:二,选择题(每题1分,共15分)1()限制性核酸内切酶是由细菌产生的,其生理意义是A修复自身的遗传缺陷B促进自身的基因重组C强化自身的核酸代谢D提高自身的防御能力2()生物工程的下游技术是A基因工程及分离工程B蛋白质工程及发酵工程2C基因工程及蛋白质工程D分离工程及蛋白质工程3()基因工程操作常用的酶是:(I内切酶II连接酶III末端转移酶IV聚合酶A.I+IIB.I+III+IVC.II+III+IVD.I+II+IV+III4()限制性内切核酸酶的星星活性是指:A在非常规条件下,识别和切割序列也不发生变化的活性.B活性大大提高C切割速度大大加快D识别序列与原来的完全不同5()下列五个DNA片段中含有回文结构的是A.GAAACTGCTTTGACB.GAAACTGGAAACTGC.GAAACTGGTCAAAGD.GAAACTGCAGTTTC6()关于cDNA的不正确的提法是:A同mRNA互补的单链RNAB同mRNA互补的含有内含子的DNAC以mRNA为模板合成的双链RNAD以上都不正确7()下列有关连接反应的叙述,错误的是A.连接反应的最佳温度为37℃B.连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%C.连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mMD.连接酶通常应过量2-5倍38()T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起,其底物的关键基团是A.2'-OH和5'–PB.2'-OH和3'-PC.3'-OH和5'–PD.5'-OH和3'-P9()载体的功能是A.外源基因进入受体的搭载工具B.不能为外源基因提供整合能力C.不能提供复制能力D.不能为外源基因提供表达能力10()黏性末端连接法,不仅操作方便,而且A产生新切点B易于回收外源片段C载体不易环化D影响外源基因的表达11()下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大A质粒B黏粒C酵母人工染色体(YAC)Dλ噬菌体12()考斯质粒(cosmid)是一种A.容量最大一种载体B.由λ-DNA的cos区与一质粒重组而成的载体C.是一种单链DNA环状载体D.不能在受体细胞内复制,但可以表达413()某一重组DNA的载体部分有两个BamHI酶切位点.用BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子,其长度总和与已知数据吻合,该重组分子插入片段上的BamHI酶切位点共有A.4个B.3个C.1个D.2个14()下列哪一种酶作用时需要引物A限制酶B末端转移酶C反转录酶DDNA连接酶15用下列方法进行重组体的筛选,只有()说明外源基因进行了表达.(a)Southem印迹杂交(b)Northem印迹杂交(c)Western印迹(d)原位菌落杂交三,简答题(每题5分,共25分)1,简述获得目的基因常用的几种方法.2,什么是α-互补筛选3,简述酶切反应体系及反应条件4,核酸操作的基本技术有哪些5,限制性核酸内切酶有几种类型常用是哪种类型并简述其特性.四,论述题(每题10分,共40分)1论述重组子的筛选和鉴定常用的方法.2基因工程基本操作程序.3试述5′RACE技术原理和方法4试举例说明基因工程中为什么常用大肠杆菌作为工程菌5基因工程试题标准答案及评分标准B一,选择题(每题1分,共15分)1,D2,A3,A4,D5,D6,C7,A8,C9,D10,C11,C12,B13,D14,C15,C二,名词解释(每题2分,共20分)1,严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程2,质粒不亲和性:在没有选择压力的情况下,两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象.3,cDNA文库:是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合.4,RACE:是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3,或5,端之间未知序列的方法.5,基因文库:通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物,组织,器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体.6,RT-PCR:先用逆转录酶作用于mRNA,以寡聚dT为引物合成cDNA第一链,然后用已知一对引物,扩增嵌合分子,这种方法称为逆转录PCR7,载体:指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具,它的本质是DNA复制子.8,S-D序列:在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上,含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3,末端碱基互补的序列,该序列最初由6Shine,Dalgarno发现,故后来命名为Shine—Dalgarno序列,简称S-D序列.9,穿梭质粒载体:指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记,因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体.10,MCS:指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段.三,简答题(共25分,每题5分)1,什么是包涵体重组蛋白在胞内表达时,常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在,这种晶状体即包涵体.包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象,这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合,而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白.2,什么是α-互补筛选质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因(lacZ),当外源DNA插入到它的lacZ,可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活,利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子.有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列,质粒载体中含有别一部分编码序列,当质粒转入载体后,可形成具有酶活性的蛋白质.这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补.3,限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响⑴酶的纯度.⑵DNA样品的纯度.⑶DNA的甲基化程度.⑷酶切反应的7温度与时间.⑸DNA分子的构型.⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液.4,核酸操作的基本技术有哪些①核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交5,基因工程诞生的理论基础是什么是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明.理论上的三大发现:①证实了DNA是遗传物质②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明:①限制核酸内切酶的发现与DNA切割②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接③基因工程载体的研究与应用四,问答题(每题10分,共40分)1如何有效地提高外源基因的表达效率⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平:①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷:①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性,防止其降解:①克隆一段原核序列,表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质2试述载体构建一般方法A目的基因分析(1)ORF分析(2)酶切位点分析B载体选择与分析(1)多克隆位点分析(2)抗性标记分析(3)启动子与其8他筛选标记分析C连接体系与连接时间确定3试述5′RACE技术原理和方法PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术(RACE).如果已知mRNA的一片段链内短序列,据此或设计基因特异引物,用原先存在的poly(A)尾(3′末端)或附加的同聚尾(5′末端)互补的序列做末端引物,就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列.为获得5′末端部分cDNA克隆需用基因特异引物,产物第一链产物,可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly(A)尾.通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA.4大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么优点:大肠杆菌培养方便,操作简单,成本低廉,基础生物学,分子遗传学等方面的背景知识清楚,对其基因表达调控的分子机理也比较了解,而且历经二十年的基因工程实践,大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系,有多种适用的寄主菌株和载体系列,大肠杆菌易于进行工业化批量生产.缺点:在通常情况下,细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰,如正确的折叠和组装,而细菌中通常并没有这样的修饰机制,从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白;外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别,并被当做异已分子降解掉.