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第十三章生化药物和基因工程药物分析概念•基本要求•概述•质量检验的基本程序与方法•常用定量分析方法及其应用•练习与思考返回主目录基本要求1．掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。2．掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。3．熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。4．了解本类药物含量测定的其他方法。返回一、防病、治病的三大药源第一节概述biopharmaceuticsorbiopharmaceuticalsbiochemicaldrugsbiotechnologydrugsbiologicalproducts药物化学药物生物药物中药生化药物生物技术药物生物制品1．生化药物：例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。动物植物微生物提取现代生物技术生命基本物质及衍生物降解物大分子的结构修饰物生物-化学半合成2.基因工程药物：以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。DNA重组技术（基因工程）：生产过程为天然基因合成的核苷酸序列内切酶连接酶载体重组的遗传物质转移到宿主细胞增殖、表达分离纯化目的产物二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及其降解物和衍生物类药物1．生化药物2．基因工程药物的种类1）激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素2）细胞因子类药物：人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素3）酶类及凝血因子类药物三、特点1.生物体的基本生化成分2.分子量大:分子量测定3.结构难确证4.全过程的质量控制：原料、生产过程、最终产品5.生物活性检查6.安全性检查7.效价（含量）测定：理化法：有效成分的含量效价测定和酶活力测定：有效成分的生物活性返回生化药物和基因药物质量控制的项目：来源与种类纯度性状干燥失重或水分鉴别炽灼残渣氨酸组分分析生物活性肽图热源试验糖含量含量分析第二节质量检验的基本程序与方法一、鉴别理化鉴别法：化学鉴别法紫外分光光度法HPLC法生化鉴别法：酶法电泳法等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验（一）理化鉴别法1.化学鉴别法：例：溶菌酶-CONH-+Cu2+络合显色药物+试剂现象颜色沉淀2.紫外分光光度法溶剂：0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠浓度：20μg/ml判断：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。4.酶法：例：尿激酶的鉴别---气泡上升法原理：牛纤维蛋白原牛凝血酶蛋白结块尿激酶牛纤维蛋白溶酶原结块溶解：气泡上升方法：取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法操作，凝结块在2小时内不溶。5.电泳法：以肝素鉴别为例。OOOOOOHCOO-OSO3-HNSO3-CH2OSO3-与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。6.生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。（二）杂质检查一般杂质检查特殊杂质检查：原料药纯度分析生产过程中杂质的检查1.原料药纯度分析：多糖类-----低聚糖、核酸、蛋白质酶类药物-----酶催化反应基本产物的分析，具有一定活性的其他有关酶的检查。例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为2500个胰蛋白酶单位中不得大于50单位，按每1mg胰蛋白酶为2500个单位和每1mg糜蛋白酶为1000单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为5%（g/g）。1:1000=x:50x=0.05（mg）L=0.05/1=5%2.生产过程中杂质的检查（三）安全性试验热源试验异常毒性试验:急性毒性物质过敏试验：异性蛋白降压物质试验：导致血压降低的杂质、组胺、类组胺无菌试验：活菌基因工程药物中可能杂质与污染物检查来源于宿主细胞的残留DNA，外源性杂质致突变试验生殖毒性试验（四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量：适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。生物效价或酶活力单位：适用于酶类、蛋白质类药物。含量测定方法：理化分析法：化学分析法：重量测定法、滴定分析法电化学分析法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、灌注色谱法、HPCE法酶法：酶活力测定法、酶分析法电泳法生物检定法返回1．电化学分析法药物膜电极生物组织膜电极药物电极微生物电极离子选择性电极法免疫电极免疫场效应管酶电极第三节常用定量分析方法及其应用2.HPLC法1）RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸柱：RP—18，柱温：48℃流动相：A--0.05%TFA；B--乙腈-异丙醇（4：1）梯度洗脱荧光检测器：ex=280nm～340nm,em=430nm测定：样品---肽样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2，110℃，20h～24h。样品干燥：真空样品的衍生化：丹酰氯水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/LNaOH进样测定N(CH3)2SO2ClR-NH2SO2NHRN(CH3)2+2）HPIEC测定对象：蛋白质，多肽柱：离子交换键合相流动相：0.3mol/L～1.0mol/L的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤素类盐特点：可回收活性蛋白。3）HPGFC应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量的测定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流动相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4（1:1）0.05%叠氮化钠标准蛋白分子量曲线的制备：醛缩酶血清白蛋白右旋糖苷蓝碳酸酐酶抑蛋白酶肽酪氨酸T0完全排阻完全进入填料空隙Tt标准蛋白分子量曲线：Kd--lgM.W.样品测定：Kd=T-T0Tt-T0测定样品的T查出Kd计算lgM.W.计算M.W.应用示例：ChP（2000）重组人胰岛素的质量控制1）鉴别：法1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。法2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别进行梯度洗脱，供试品的肽图谱与对照品的肽图谱一致。2）检查：检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌、细菌内毒素。有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超过3.0%。高分子蛋白质：固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量为5000～6000的球状蛋白。流动相：0.4mol/L碳酸氢铵-乙腈（69:31）测定：分别测定供试液（1mg/ml）和对照液（将供试液稀释成0.01mg/ml），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不大于对照液主峰面积（限量1.0%)。3）效价测定：固定相：ODSC18流动相：硫酸盐缓冲液-乙腈（74︰26）系统适用性试验：测定胰岛素主峰和A21脱氨胰岛素峰之间的分离度与拖尾因子。含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计算含量。3.灌注色谱法固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构成贯穿孔颗粒分离介质----POROSR。双模式孔结构：80～150nm大扩散孔600～800nm贯穿孔允许液体传送流经过分离介质内表面，使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中，扩散作用不再是主要的。介质颗粒内部可利用反应的表面积增加，容量和分辨率也随之增加，可使生物活性大分子快速分离纯化。灌注色谱预添充柱分析型F系列：用于BioCAD工作站或中压系统M系列：用于BioCAD工作站和传统HPLC的分离纯化P系列：用于低压、BioCAD工作站或中压系统制备型H系列：用于BioCAD工作站和传统HPLC系统（POROS10）灌注色谱预添充柱反相柱阴离子交换柱阳离子交换柱亲和色谱柱活化的亲和色谱柱疏水性相互作用色谱柱R