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药物分析第一章概况药典基本结构凡例正文附录索引（中英文）凡例解释和正确使用CHP进行质量检定的基本原则，并对有关共性问题进行规定1）名称及编排2）项目与要求3）检验方法和限度4）标准品、对照品用于鉴别、检查和含量测定的标准物质。不包括色谱用的内标标准品：是指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位或ug计。对照品：除另有规定外，均按干燥品或无水物计算后使用。5）计量法定计量单位6）精确度取样量的准确度和实验精密度精密称定：准确至所取重量的千分之一称定：准确至所取重量的百分之一取用量约若干：指该量不得超过规定量的正负10%。精密量取：量取体积的准确度应符合该体积移液管的精密度要求称取：根据数据的有效数位确定分别称取：2g2.0g2.00g则可称：1.5-2.0g1.95-2.05g1.995g-2.005g量取：用两桶或按照量取体积的有效数位选用量具恒重：供试品连续两次干燥或炽灼后称重的差异在0.3mg以下的重量。按干燥品计算：除另有规定外，应取未经干燥的供试品进行试验，测得干燥失重后，再在计算式从取用量中扣除空白试验：不加供试品或以等量溶剂替代供试液，同法操作所得结果。第二章药物的鉴别试验目的：项目：1.性状外观溶解度物理常数（熔点m.p，比旋度：在一定波长与温度下，偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度吸收系数：在给定的波长，溶剂温度等条件下，吸光物质在单位浓度，单位液层厚度时的吸收度）2.一般鉴别试验（generalidentificationtestGIT）根据某一类药物的化学结构或物化性质，通过化学反应鉴别药物的真伪。只能证实药物的类别，不能证实是哪一种药物，区别不同类别的药物。仅适用于确认单一的化学药物。3.专属鉴别试验(SPECIFICIDENTIFICATIONTEST,SIT)在git的基础上进行，根绝每一种药物在化学结构和理化性质上的特殊性差异，采用更灵敏、选择性更强的反应，进一步鉴别药物的真伪。区别同类药物。方法验证：化学法，光谱法，色谱法，生物学法最低检出量：应用某一反应，在一定反应条件下，能观测除反应结果所需的供试品的最小量。空白试验：消除试剂和器皿可能带来的影响对灵敏度很高的鉴别试验，很重要提高反应灵敏度的方法：消除干扰改进观测方法加入少量与水互不相容的有机溶剂，颜色加深，易观察第三章药物的杂质检查第一节、杂质来源：①生产过程中引入（合成药，药物制剂的生产过程中，引入溶剂、酸碱性试剂、催化剂，从金属工具中引入金属杂质，引入低效无效的药物异构体或晶型）②贮藏过程中引入，（保存不善或贮藏时间过长，微生物作用，外界条件影响导致水解、氧化、霉变、异构化、晶型改变）杂质限量：含义，在不影响药物的疗效和不产生毒性的情况下，药物中可允许的咋质量。即药物中允许杂质存在的最大量。杂质限量检查：不要求测定杂质的含量，只需检查杂质是否超过限量。方法：①对照法：去一定量被检杂质的标准溶液与一定量供试品在相同条件下处理后，比较反应结果。特点：注意平行操作，不需知道杂质的准确含量杂质限量=（杂质最大允许量/供试品量）*100%=【（标准溶液的浓度*标准溶液的体积）/供试品量】*100%②灵敏度控制法，在供试品溶液中键入试剂，一定条件下反应后，观察有无正反应出现。以不出现正反应为合格。特点：不需对照品。③比较法：取供试品一定量依法检查，测定特定待检杂质的参数（如吸光度）与规定的限量进行比较，不得更大一般杂质的检查方法，①化物检查法原理方法1、反应试剂：AGNO3试液，2、标准溶液：标准NACL溶液，每1ml相当于10ug的cl-适宜比浊浓度：50-80ugcl-/ml原理氯化物AGNO3硫酸盐Bacl2铁盐SCN-重金属硫代硫酸钠砷盐古蔡式法zn+hcl产生H2,+AsSO33-生成ASH3炽浊残渣硫酸灰分残留溶剂加入过硫酸钠的作用，将fe2+氧化成fe3+,防止光纤将硫氰酸铁离子还原或分解第四章药物定量分析与分析方法验证药物定量分析方法：一、容量分析法二、光谱分析法三、色谱分析法一、容量分析法1.关键：准确地确定等当点（滴定液与被测药物完全作用，反应达到化学计量点即等当点）2.滴定误差：滴定终点与等当点之间的误差3.特点简便，快速，精密、准确专属性、灵敏度差常用于化学原料药的含测滴定度T：每ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量（mg)aA+bB⇌cCT=m×(a/b)×M（mg/ml）百分含量计算直接滴定：含量%=生成物滴定法：•剩余滴定（做空白实验）：先加入定量过量的滴定液A,当与被测药物反应完全后,再用另一滴定液B回滴剩余的滴定液A含量%=：空白试验消耗滴定液B的体积：样品测定消耗滴定液B的体积二、光谱分析法（一）UV-Vis分光光度法1.Lambert-Beer定律A=CL：百分吸收系数2.特点：较灵敏、较准确；专属性差3．仪器校正和检定波长校正：仪器使用前校正杂散光的检查吸收度准确度的检定：用重铬酸钾的硫酸溶液检定对溶剂的要求：截止波长，纯度溶剂在所选波长附近的吸收度应不超过一定值。空气为空白4．测定核对检测波长:供试品的实际吸收峰波长是否与药典给出的波长一致(±2nm)如果不一致，可能与试样的真伪、纯度及仪器波长的准确度有关.以配制供试品溶液的同批溶剂为空白供试品溶液：吸收度0.3-0.7；溶质没有离解、聚合等选择合适的定量方法测定对照品比较法比色法%100WFTV%100)(0WFTVVBAsBB0BVsBV吸收系数法计算分光光度法（二）荧光分析法1．特点:灵敏度高于UV;荧光淬灭；干扰多应在低浓度溶液中进行高浓度：产生内滤光效应和自吸收现象线性偏离内滤光效应：溶液中存在能吸收激发光和荧光的物质，使荧光强度减少。空白试验排除干扰溶剂纯度，溶液中的微粒、溶氧、pH、温度、光照等校正仪器灵敏度：供试品对激发光稳定：用待测物的对照品溶液校正供试品对激发光不稳定：采用激发、发射光谱与供试品近似且稳定的物质校正蓝色荧光---硫酸奎宁的稀硫酸溶液黄绿色荧光---荧光素钠水溶液红色荧光---罗丹明B水溶液2．含量测定•对照法：荧光强度与药物浓度线性关系良好时用Cx=×Cr•标准曲线法：荧光强度与浓度明显偏离线性时用三、色谱分析法特点：高效，快速，高灵敏度，高专属性1．HPLC法最常用固定相：octadecylsilane-bondedsilicagel十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18）流动相及其pH：RP-HPLC首选甲醇-水，乙腈-水pH2-8(以硅胶为基质的键合固定相）柱温、检测器：室温、紫外检测器固定相种类、流动相组分和检测器类型不得任意改变外系统适用性试验色谱柱的理论塔板数色谱峰的分离度色谱系统的重复性色谱峰的拖尾因子药物分析中常用的HPLC定量方法：–内标法：内标校正曲线法内标一点法：对照法内标校正因子法–外标法：标准曲线法外标一点法：对照法气相色谱法药品标准中规定的色谱条件除固定液品种、检测器类型及特殊指定的色谱柱材料不得任意改变外rbrxbxFFFF药物分析方法的验证：根据分析项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所建立的分析方法是否科学、合理。保证分析结果的准确、可靠。药品质量标准中需验证的分析项目：鉴别试验杂质限度或定量检查原料药或制剂中有效成分的含量测定制剂中其它成分的含量测定含量均匀度、溶出度、释放度测定方法验证内容：准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性一、准确度accuracy含义：测定结果与真实值的接近程度表示：回收率试验样品：原料的含测：药物的对照品制剂的含测：处方量的空白辅料+药物的对照品已经测得含量的制剂+药物的对照品杂质定量：已经测得杂质含量的原料药或制剂+杂质对照品溶出度测定：空白溶出介质+药物的对照品二．精密度precision含义：指在规定的测试条件下，对同一个均匀供试品，经多次取样测定，所得结果之间的接近程度。表示：标准偏差SD相对标准偏差relativestandarddeviationRSD试验样品：供试品试验内容：重复性、中间精密度、重现性三．专属性specificity（选择性selectivity）含义：有其他成分（如杂质、辅料等）存在时，分析方法能准确测定出被测物的特性，即分析方法排除各种干扰的能力。表示：对鉴别试验：不含被测物的供试品，应呈负反应对杂质检查和含量测定：被测物应能与其它成分分离给出代表性图谱，说明专属性四．检测限limitofdetection,LOD含义：指供试品中被测物能被测定出的最低浓度或量。反映分析方是否具有灵敏的检测能力，没有定量意义。试验样品：处方量的空白辅料+药物的对照品（对药物制剂）药物的对照品（对原料药）测定方法：（1）目视法，标准偏差法（2）信噪比法：适用于能显示信号和基线噪音强度的仪器分析方法LOD为S/N=3时的对应浓度或注入仪器的量检测限验证：浓度等于检测限的实际样品，进行分析，测试图谱五．定量限limitofquantitation,LOQ含义：指供试品中被测物能被定量测定的最低浓度或量测定结果应有一定准确度和精密度反映了分析方法定量测定的灵敏度试验样品：处方量的空白辅料+药物的对照品（对药物制剂）药物的对照品（对原料药）信噪比法测定：S/N=10时，被测物浓度或注入仪器的量定量限验证：测试图谱，测试结果的准确度、精密度六．线性linearity含义：在设计的“范围”内，测试结果与样品中待测物浓度或量直接呈正比关系的程度。试验样品：被测物的对照品数据要求：回归方程、相关系数和线性图,至少5个点，相关系数大于0.999七.范围range含义：达到一定精密度、准确度和线性，分析方法适用的高、低限浓度或量的区间。常见规定范围：原料和制剂的含测：测试浓度的80%～120%制剂含量均匀度测定：测试浓度的70%～130%溶出度或释放度测定：限度值的±20%杂质的含测：规定限度的±20%试验样品：供试品八．耐用性robustness含义：当测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。试验样品：供试品常见变动条件：供试品溶液的稳定性样品制备方法HPLC中流动相组成的比例，pH，流速色谱柱的厂牌、批号，柱温等GC：色谱柱的厂牌、批号，固定液和载体的类型，柱温等。第五章体内药物分析概述体内药物分析的特点体内样品的特点待测物浓度低、游离/结合物；干扰物多；样品数多、量小。体内药物分析的特点体内样品需要分离、浓集；分析方法需专属、灵敏；分析工作量大、复杂1．血样常用稳定剂：酶抑制剂（NaF、三氯醋酸）抗氧剂2．尿样测定尿药浓度的目的：药物剂量回收，药物清除率，药物代谢和生物利用度尿样特点：药物浓度较大但易变，体积大采样：常用时间尿保存：立即测定；4℃保存；放置较长时间需冷冻；加入防腐剂：甲苯，氯仿，醋酸等（二）常用预处理方法1、体内样品中蛋白质的去除（1）目的：去除蛋白质，释放结合型药物或代谢物，便于测定总浓度；预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成；保护仪器性能。（2）方法：蛋白质沉淀法•与水相混溶的有机溶剂：乙腈，甲醇，丙酮，THF•中性盐：饱和硫酸铵，硫酸钠，磷酸钠，NaCl，枸橼酸盐•强酸：10%三氯醋酸，6%高氯酸•热凝固法：可将热变性蛋白质除去酶解法•适用于与蛋白质结合牢固及遇酸或遇热不稳定的药物•常用蛋白水解酶中的枯草菌溶素（细菌性碱性蛋白分解酶）2、体内样品中缀合物的水解缀合物（conjugate)：药物或代谢物与内源性物质（葡萄糖醛酸，硫酸等）结合生成的产物;极性大.（1）目的：使缀合物中的药物或代谢物游离，便于用有机溶剂提取测定尿液中药物的总量3、体内样品中药物或代谢物的分离定量分析方法的建立与验证分析方法的选择：首选色谱法色谱条件选择及优化量方法的选择：首选内标法建立体内药物分析方法的基本步骤1．色谱条件的初步选择2.空白生物基质试验——方法特异性3．模拟体内样品试验——方法效能指标4．实际体内样品测试——方法特异性体内定量分析方法的验证：专属性准确度精