蛋白质的电泳分离

蛋白质的电泳分离在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的原理蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。SDS-PAGE的特点1.大多在不连续缓冲体系中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液；2.不连续缓冲体系具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故提高了SDS-PAGE的分辨力；3.系统中所有组分都含有0.1%的SDS。负极积层胶分离胶加样孔正极配置积层胶分离胶丙烯酰胺浓度5%10-15%Tris-HCl1M，PH=6.81.5M，PH=8.8SDS，过硫酸铵，TEMED浓度相同电泳积层胶分离胶电压80V120VTris-HCl-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)在凝胶中的电离情况甘氨酸→带负电的蛋白质亚基→Cl-带负电的蛋白质亚基→甘氨酸-→Cl-被分离蛋白质亚基的电离情况蛋白质亚基由于甘氨酸的挤压作用，在积层胶不被分离，而是被浓缩为最小体积蛋白质亚基在分离胶根据分子量的大小被分离考马斯亮蓝染色(0.1-1.0ug的多肽)One-DimensionalSDS-PAGETwo-DimensionalSDS-PAGEPI(byisoelectricfocusing–IEF)Approximatemolwt.(bySDSPAGE)Exampleof2D-GelSeparationofProteins2Dgelsareidealtoolsofproteinseparationbecauseoftheirhighresolution(1000spotsarecommonlyvisualizedonasinglegel)andvisualreadoutIsoelectricFocusing(IEF)等电聚焦电泳的过程电泳时可将样品置于凝胶的任何位置；初始位置在负极时，因pH＞pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；移动过程中，pH逐渐下降，所带负电荷量逐渐减少，蛋白质移动速度减慢；当移动到pH=pI时，蛋白质所带净电荷为零，蛋白质即停止移动；各种不同蛋白质在电泳结束后，会分别聚集于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带；区带的位置是由pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小和形状无关。1）蛋白提取2）SDS-PAGE3）转膜4）封闭5）一抗作用6）标记二抗作用7）显色Westernblotting实验操作：