蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用

第11章蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用第一节引言第二节蛋白质组学研究基本技术第三节微生物蛋白质组学主要内容第一节引言背景基因组时代→后基因组时代核苷酸序列本身很难直接与生命功能和生命现象挂起钩，而蛋白质才是生物功能的最终执行者。蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。mRNA水平的基因表达研究取得进展，但mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到解答蛋白质组学的概念蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，被定义为：一个基因组/一种生物或一种细胞/组织所表达的全部蛋白质。对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组是：蛋白质组学(proteomics)指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组学研究的内容•蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行表征,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。双向凝胶电泳(2-DＥ)和质谱(Massspectrometry)技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术•蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系)的研究大规模的蛋白质分析过程样品制备是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。蛋白质分离（技术）：二维电泳（核心技术）、多维色谱蛋白质分析与鉴定（技术）：质谱技术（核心技术）、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术等。★蛋白质组发展的瓶颈是缺乏自动化的蛋白质分析的完整途径。第二节蛋白质组学研究基本技术典型的蛋白质组学研究常分为四个步骤：从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液分离蛋白质混合液将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴定和解析蛋白质技术的进步。重要技术突破主要包括三点：固相化PH梯度二维电泳（IPG-2-DE)的发明与完善；生物质谱，即应用软电离技术对生物大分子进行分析的质谱技术的发展；生物信息学发展。一、蛋白质组研究中的蛋白质分离（一）、二维（双向）凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：◆利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。原理◆第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦电泳技术(IEF)将蛋白质混合物按照等电点高低进行分离,再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照相对分子质量大小进行蛋白质分离。◆1975年首先由O’Farrell等创立。特点可分离10～100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配第一向IEF电泳传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。pH凝胶制作的不稳定和重复性差限制了等点聚焦电泳技术的应用，Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将之应用于双向电泳。优点固相pH梯度等电聚焦的优点◆克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。◆稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。第二向SDS-PAGE电泳垂直板电泳水平超薄胶电泳双向电泳典型过程包括：①蛋白质样品制备：要防止蛋白质酶降解蛋白质。②上样一种是IPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上样。别一种是将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时样品出参入了胶条。③IPG的运行和平衡④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳⑤胶上蛋白质检测和定量：荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远高地银染，与质谱兼容性好。⑥图像采集、分析及数据处理2-DE技术的缺点◆所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分离范围一般为8~200kD，对极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于有效分离。◆在2－D胶上有些蛋白质点量太少，难以进行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低难于与质谱联用实现自动化性质联用。2、新型非凝胶技术◆高效液相色谱法Highperformanceliquidchromatography，HPLC◆毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CE◆液相等点聚焦和毛细管色谱capillaryelectrochromatography★特点：自动化程度高、分辨率高，检测限低。采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究的基本路线在非凝胶分离技术中，高效液相色谱由于其分离原理多样，易于组合多维分离模式和与质谱直接联用而获得了广泛的研究和应用。高效液相色谱的原理：溶于流动相中各组分经过固定相时，与固定相发生相互作用，由于相互作用大小、强弱的不同，各组分在固定相中滞留的时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同，最终使不同组成成分得到分离。经典的高效液相色谱系统由输液系统、进样系统、分离系统和检测系统构成。质谱起到了检测器的作用。液质联用技术（LC-MS/MS）蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology)从色谱柱中流出有多肽直接进入质谱分析进行蛋白质鉴定。二、生物质谱与蛋白质鉴定（一）、基本原理质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。个完整的质谱分析仪由进样系统、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统5个部分组成■四极杆质谱（quadrupole,Q）、■离子阱质谱（iontrap,IT）飞行时间质谱（timeofflight，TOF）傅里叶变换离子回旋共振质谱（fouriertransformcyclotronresonance,FTICR）常用的质谱分析技术电喷雾离子化（electrosprayionization，ESI）和基质辅助激光解吸电离（matrix-assistedlaserdesorptionionization，MALDI）等软电离技术的发明和成熟才使质谱技术真正应用到生物大分子分析领域，使得在fmol(10-15)乃至attomole(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能。这也使得有机质谱发展成为了一个崭新的领域——生物质谱。电喷雾离子化：是利用喷口的高电场使质谱仪进样端毛细管柱流出的含有样品的液体成为带电荷的微滴。随着挥发性溶剂的蒸发，微滴半径减少而表面电荷密度增加，直至达到一定临界值，液滴爆裂为带电荷的子微滴。这一过程不断重复使最终的微滴非常细小呈雾状。这时液滴表面的电场很强，使蛋白质等被分析分子离子化并以带一个或多个电荷的离子的形式进入气相。基质辅助激光解吸电离：是将样品均匀包埋在固体基质并形成晶体，当用337nm的氮激光照射晶体时，基质吸收激光提供的能量而汽化，样品分子解吸附，基质－样品间发生电荷转移使样品分子电离。“软电离”的特点分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。•在蛋白质组学研究中，为了提高质谱的适用范围和工作性能，常将不同类型的质量分析器串联起来使用。因此，目前最为常用的质谱分析系统包括两大类：•以单一质谱为基础的–电喷雾－三级四级杆质谱–电喷雾－离子阱质谱–电喷雾－傅里叶变换离子回旋共振质谱–基质辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱•以串联质谱为基础的–电喷雾－三级四级杆－飞行时间质谱–基质辅助激光解吸离子化－三级四级杆－飞行时间质谱–基质辅助激光解吸离子化－串联飞行时间质谱（二）、应用生物质谱鉴定蛋白质•肽质量指纹谱（peptidemassfingerprinting，PMF）是蛋白质的一种重要属性，也是目前蛋白质组学研究中鉴定蛋白质的常春藤用研究方法之一。1993年由多研究小组分别独立提出。•肽质量指纹谱指的是蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶切割后得到的一套特征性有肽片断质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列都不相同，蛋白质被特异性的蛋白酶消化后所产生的肽片断序列及其质量的构成也具有特异性，可用于与数据库中所有蛋白质酶解的理论肽质量谱匹配来鉴定蛋白质。•目前测定肽混合物质量质量谱最有效的质谱仪是基质辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)，适合测定的相对分子质量范围在五百到数千道尔顿，并需要用已知相对分子质量的蛋白质作内标。鉴定和注释蛋白质的路线通过肽质量谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配仪器MALDI-TOF－MS质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小.缺点：只能鉴定数据库中已经存在的蛋白质，而且有一部分蛋白质在只有PMF信息时不能得到可靠的鉴定，因此需要进一步分析肽段的序列信息来鉴定蛋白质串联质谱的肽序列标签（PST）应用串联质谱中得到的部分氨基酸序列结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中检索以鉴定蛋白质，称为肽序列标签技术。相比单独的肽质量指纹谱技术，PST搜索数据库得到的结果更可信。一般串联质谱仪电喷雾－串联质谱（ESI-MS/MS)可用于肽段序列的测定。组织切片或印片原位质谱分析技术两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）联合技术精确鉴定蛋白质概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。（三）、定量蛋白质组学研究低丰度蛋白质检测困难蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈蛋白质表达的瞬时变化蛋白质定量的难点目前常用的蛋白质组定量方法包括：1、基于荧光染色技术的电泳定量法2、基于稳定同位素技术的质谱定量法1．基于荧光染色技术的电泳定量法双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种方法。荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）用于蛋白质检测的荧光染料有两大类：一类能与蛋白质共价结合的荧光染料，如花菁染料Cy3,Cy5.另一类是非共价结合荧光染料，包括苯乙烯基染料Sypro系列、尼罗河红等。荧光染色常用的方式有两种：二维电泳前进标记电泳后标记2、基于稳定同位素技术的质谱定量法◎同位素标记法基本原理：将待比较的一对肽段样品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标记和未标记肽段的相对丰度。◎同位素标记方法有：○体内标记（代谢标记）○体外标记：根据标记部位又可分为：巯基（－SH）标记、氨基标记和羧基标记三、微生物蛋白质组学（一）病毒微生物蛋白质组学由于病毒微生物与感染性疾病密切相关，研究这些致病微生物的蛋白质组学对于了解其毒性因子、抗原以及疫苗的制备非常重要。在已完成基因组测序的47种致病苏白及其菌株中，有14种已进行过蛋白质组研究，其中对大肠埃希菌、流