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考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量：分光光度的使用【实验目的】1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法。2.熟练分光光度计的使用和操作方法。【实验原理】考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。在一定蛋白质浓度范围内(1～1000µg/ml）,蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。由于染色法简单迅速，抗干扰性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的蛋白质快速微量测定方法。【器材与试剂】（一）器材1.可见光分光光度计2.刻度移液管3.移液枪4.新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等（二）试剂1.0.9%生理盐水2.考马斯亮蓝试剂3.1000µg/ml蛋白质标准液【分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法】定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。特点:灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。应用:生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。分光光度计的分类红外分光光度计:可见光分光光度计:紫外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区测定波长范围为400~760nm的可见光区测定波长范围为200～400nm的紫外光区可见光谱可见光范围内波长和颜色的关系分光光度计的基本结构无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:入射光强度Io透射光强度I样品池检测器及仪表单色器光源光照射到物质上，物质的分子结构决定哪些特定波长的光被吸收。这一现象符合符合朗伯－比耳定律。入射光强度Io样品浓度c光程b透射光强度I当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)朗伯—比尔定律:A=lg(1/T)=KbcA为吸光度;T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0);c为吸光物质的浓度;b为吸收层厚度(光程）.物理意义当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.测量条件选择（1）仪器预热是保证仪器准确稳定的重要步骤。（2）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。比色皿与分光光度计应配套使用。比色皿内盛液应为其容量的2/3。（3）选择适宜波长的入射光：由于物质对光有选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度，必须选择溶液最大吸收波长的入射光。（4）控制吸光度A的准确的读数范围：吸光度控制在0.1~0.8读数范围内时，测量的准确度较高。（5）选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作零点的。无色样品可用蒸馏水作参比溶液；反之应采用不加样品（加显色剂）的溶剂作参比溶液。722型光栅分光光度计使用方法100调波长旋钮电源开关T/A切换旋钮消光零0灵敏度暗盒盖比色皿拉杆显示窗口1．调整（1）接通电源。（2）调波长调节器至所需波长。（3）开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透光率[100%T]。预热20min.预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。2．校正（1）打开吸收池暗室盖，调节[0%T]旋钮，使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路，盖上吸收池盖，调节透光率[100%T]旋钮，数字显示为“100.0”。（2）如果显示不到“100”，则可适当增加电流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度后必须重新校正“0”和“100”。（3）按（1）连续几次调整“00.0”和“100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行吸光度A的测量.3．测定将待测样品的比色皿放入相应的样品穴，轻轻拉动比色皿座架拉杆，使待测溶液进入光路，测定。显示值（小数后三位数）即为待测样品的吸光度值Ａ。读数后，打开比色皿暗箱盖。4.关机实验完毕，切断电源，将各调节旋钮恢复至初始位置。将比色皿取出洗净，晾干，存于专用盒内，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。【注意事项】1）为了防止光电管疲劳不测定时须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。2）比色皿的使用方法：①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面。②每次做完实验时，应立即洗净比色皿。清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。必要时可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，。不能用毛刷清洗。③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。3）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。【实验步骤】（一）、标准曲线的制作1.取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。试剂试管编号1234561000µg/ml标准蛋白溶液（µl）0204060801000.9%生理盐水（µl）100806040200蛋白质含量（µg/0.1ml）0204060801002.分别向上述各管加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂,充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。3.以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。（二）样品提取液中蛋白质含量的测定1.蛋白质提取:称取样品约200mg，加蒸馏水5ml，匀浆，4000rpm离心10min，取上清液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，4000rpm离心10min，合并上清液并定容至10ml。2.蛋白质含量测定:取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合,放置5min后，测A595值。3.根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。样品蛋白质含量（µg/g鲜重）=m(µg)×提取液总体积(ml)测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）式中：m为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为µg。（三）、结果计算