液相色谱基础

HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation液相色谱基础知识SHIMADZUHPLCBusinessDeptShimadzuCorporation液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation液相色谱基础知识采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation水/甲醇梯度ODS柱鬼峰1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶剂等级鬼峰的出现HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation甲醇乙睛正己烷分析纯级(实线）和HPLC级溶剂（虚线）的吸光度比较溶剂等级HPLCBusinessDeptShimadzuCorporationGeneralMaintenanceandTroubleshooting缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要对柱子进行清洗，以免造成腐蚀、磨损及阻塞:首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min)易受到细菌和霉菌的影响溶剂等级注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意：1）每天脱气2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶剂前处理HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation岛津VP系列输液泵目的单元流速范围特性和应用分析LC-10ADVP0.001-9.999无脉动，适于半微量LC和LC-MSLC-10ATVP0.001-9.999非凡的耐用性，适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporationLC-10ATvp泵：串联式往复泵LC-10ADvp泵：并联式微体积往复泵LC-10ADVP/LC-10ATVP工作原理HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球单向阀原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头LC-10ADVP/LC-10ATVP工作原理HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation液相色谱基础知识梯度洗脱形式：线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系梯度洗脱装置：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation梯度洗脱形式的选择HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation1.使用适宜的流动相溶解样品在溶剂选择的时候，应注意以下原则：--减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰的流动相--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在色谱柱中产生沉淀2.进样前最好使用0.45um的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样品处理HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation进样器自动进样器（SIL-10A/SIL-10Ai/SIL-10ADvp）手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation进样量和检测器响应的关系示意图VolumeofInjectionResponseofDetectorHalfvolumeofsampleloopThreetimesvolumeofsampleloopLoopinjectionPartialinjection液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation手动进样器的原理图装填状态液相色谱基础知识进样状态HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation交叉污染的原因微量注射器红色表示残留样品HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation手动进样法普通方法1.在进样状态下清洗针口2.在装填状态下插入微量注射器3.注入样品4.切到进样状态HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation手动进样法便捷方法1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation柱压低于150kgf/cm2柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃缓冲液PH使用范围为2～7ODS柱的使用注意点：硅胶在PH为3～4时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation液相色谱基础知识色谱柱的类型及适用范围硅胶基底聚合物基底pH范围2-7宽范围有机溶剂所有有限制压力〈150kgf/cm2低压温度宽范围〈60CHPLCBusinessDeptShimadzuCorporation分析柱的维护1.在使用新柱之前，最好用强溶剂如甲醇在低流量下(0.2-0.3ml/min)冲洗30mins，长时间未用的分析柱也要同样处理2.定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品5、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation症状：系统高压、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留时间的改变延长柱寿命方法：修补柱头换过滤片倒冲柱分析柱的维护HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation常用检测器紫外检测器（包括二极管阵列检测器）荧光检测器示差折光检测器电导检测器蒸发激光散射检测器液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，A＝KCL优点：1）灵敏度高2）对温度和流速不敏感3）可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation二极管阵列检测器HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）--二十一世纪标准紫外检测器色谱定性依据：保留时间常规紫外检测器峰纯度二极管阵列检测器液相色谱基础知识HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation样品池二极管阵列光栅D2/W灯每一组分可在每一波长处得到一吸光度值二极管阵列检测器HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰二极管阵列检测器的优点HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一2）选择性好3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）荧光检测器HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器，缺点：1）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度洗脱3）属于中等灵敏度的检测器示差折光检测器HPLCBusinessDeptShimadzuCorporation原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子电导检测器