液相色谱注意事项及处理

液相色谱注意事项及处理液相色谱仪原理及构成液相色谱仪的储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，因此在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。高效液相色谱仪(HPLC)是由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳;进样系统要求进样便利切换严密;由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。液相色谱仪的工作流程•固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。用来分离被测组分的物质，目的是把样品里面的成分留下，固定住；•流动相：载体，与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。是将物质带到固定相里并通过固定相的流体，在气相里就是载气，在液相里就是液体。•泵：由于色谱柱很细，填充剂粒度小，因此阻力很大，为达到快速、高效分离，必须有很高的柱前压力，以获得高速的液流。•色谱柱：分离开待测组分和其他干扰组分，有利于分别定性、定量•进样器：是在色谱系统中，能定量地将分析试样送入色谱柱的装置。其原理是计量泵定量将样品吸入定量环，通过一个切换阀转入高压流路，另外一个切换阀连接清洗溶液和清洗口，根据设置完成对计量泵内的清洗，清洗口是用来清洗针头，进样口连接高压阀，液相进样器的针头插在进样口处，为防止样品交叉污染，通常针头和进样口保持最小的接触面积（不是插入），同时两个斜面通过弹簧力压紧密封，防止高压流路在此处流出。•检测器：将色谱柱分离的化学物质作为信号源并将其转化为电压信号或电流信号，并将信号放大输出，以便记录，再通过工作站或处理机或手工处理得出分析数据。•数据系统：将检测器得出的分析数据记录保存下来。液相色谱仪注意事项•1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。•2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。•3.正常情况下，仪器首先用甲醇或柱洗液冲洗10-20分钟，然后再用流动相冲洗20-30分钟，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后，方可进样测试。•4.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。•5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉•6.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。•7.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速-流速为0.1~10.0ml/min。高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。液相色谱法•使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。•1、正相色谱法•采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。•2、反相色谱法•一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右•随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。•正相色谱法与反相色谱法比较表••从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。•3、液固色谱法•使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。•4、离子交换色谱法•固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。•5、离子对色谱法•又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。•分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。•6．排阻色谱法•固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。•按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。液相色谱中出现问题及处理•色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。•一、样品的前处理：•1、最好使用流动相溶解样品。•2、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。•3、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质•二、图谱中出现的问题及解决办法：•1、出现肩峰或分叉1）.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2）.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3）.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4）.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5）.进样器损坏更换进样器转子•2、拖尾峰•1）.原因：筛板阻塞，柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。•解决方法：需要通过反冲色谱柱，或者更换筛板。•2）.原因：色谱柱塌陷，是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失，不能对物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有一点柱效，因此形成拖尾。•解决方法：需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。•3）.原因：有污染，即样品不在同一起跑线起跑，从后面开始跑得到达终点稍晚，表现出拖尾。•解决方法：更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上，以冲洗柱子。•4）.原因：流动相PH值选择错误，如某PH下有的样品存在分子型和离子型的动态平衡，离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。•解决方法：调节PH值可抑制分子解离，改善拖尾，对于碱性化合物，相对较低的PH值更有利于得到对称峰。•3、前沿峰•1）.原因：样品过载，被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前沿峰。•解决方法：降低样品含量。•2）.原因：样品溶剂选择不恰当：•解决方法：使用流动相作为样品溶剂•3）.原因：色谱柱损坏，色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。•解决方法：更换色谱柱•4）.原因：在大峰前有小峰出现，假象前沿峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。•解决方法：调整流动相洗脱梯度。•5）.原因：柱温低：•解决方法：升高柱温•4、鬼峰•1.原因：流动相可能被污染•解决方法：重新配置新的流动相并清洗贮液瓶和溶剂入口过滤器•2.原因：样品产生降解或混入杂质•解决方法：用标准样品比较，验证样品的完整性，检查样品处理过程，更换新样品•3.原因：先前进样的流出物•解决方法：增加分析时间，如果问题继续存在，两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱•4.原因：样品定量管清洗不当•解决方法：两次进样间冲洗样品定量管•5.原因：注射器脏或被污染•解决方法：清洗注射器或更换新的注射器，冲洗进样口•6.原因：色谱柱被污染•解决方法：冲洗色谱柱或更换新的色谱柱•5、负峰或倒峰•(1)原因：流动相吸收本底值过高。•解决方法：此时可适当改变检测波长。•(2)原因：进样过程中进入空气。•解决方法：进行排气处理,直到基线平稳再进样。•(3)原因：样品组分的吸收低于流动相。•解决方法：可改变流动相或改变检测波长。•(4)原因：配制样品的溶液与流动相不一样。•解决方法：重新配制样品,用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。•一般倒峰都出现在刚刚进样后1-2分钟，这属于正常现象，因为样品通过六通阀突然的进入流动相，流动相会因为成分的突然改变作出各种各样的反应，只要不影响目标产物就可以！当然倒峰要是出现在中间或尾部，就要考虑流动相和整个系统的问题了，一般与色谱柱关系不大•6、宽峰•1.原因：色谱柱污染或失效，造成塔板数降低。•解决方法：更换同样类型的色谱更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。•2.原因：柱子与检测器之间的管路太