液相色谱的基础知识及应用概述

HPLC的基础知识及应用2007年10月26日工业催化与反应器设计实验室内部学术交流活动徐帅StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineeringContents液相色谱法发展史与分类1色谱方法基本原理2345样品分析方法的建立液相色谱的维护及注意事项软件的简单介绍及示范StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering1液相色谱发展历史与分类1.1色谱的起源(1903)Chromatography色谱M.S.TswettStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineeringIUPACdefinitionofchromatography(1993):Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection.固定相（stationaryphase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。流动相（mobilephase）：带动样品向前移动的另一相。色谱法：是一种物理化学分离方法，它利用不同组分与两相（固定相和流动相）之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，样品在两相中做相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，使不同物质达到相互分离。1.2色谱的定义StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering1903俄国植物学家Tswett以碳酸钙为吸附剂，分离植物色素1931Kuhn和Lederer重复Tswett实验分离胡萝卜素1938Kuhn和Lederer诺贝尔化学奖1940Martin和Synge提出液液分配色谱1944Consden发展出纸色谱1949Macllean等人在氧化铝中加入黏合剂制成TLC1952Martin和Synge诺贝尔化学奖1952Martin和James发表完整的气相色谱理论1956VanDeemter提出色谱速率理论1957Golay开创毛细管气相色谱法1958Stein和Moore开发自动氨基酸分析仪1.3色谱的发展历程StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering1959Porath和Flodin提出排阻色谱法1960sGiddings比较了LC和GC，总结和拓展前人的理论为液相色谱法奠定理论基础1960s将高压泵与化学键合固定相应用于液相色谱，出现了高效液相色谱系统1969JournalofGasChromatography更名为JournalofChromatography1972Stein和Moore诺贝尔化学奖Majors和Kirkland发明microparticulatepackedcolumns1977Microprocessorcontrolledpumps1978Micronpacking1983MicroborecolumnStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering1.4色谱中的分离过程定性定量串联应用样品纯化成分分析分离StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering色谱中的分离过程流动相固定相利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering1.5色谱的分类按流动相的物态分:–气相色谱(GasChromatography,GC)：用气体作为流动相(又叫载气)–液相色谱(LiquidChromatography,LC)：用液体作为流动相(又叫洗脱剂)按固定相的形态分:–平面色谱纸色谱薄层色谱–柱色谱􀂃按流动相和固定相的相对极性–正相色谱(NormalPhaseChromatography)•固定相的极性大于流动相–反相色谱(ReversedPhaseChromatography)•固定相的极性小于流动相StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineeringHPLC与GC的应用差异HPLCGC在常温下分析在高温下，分析样品必须热稳定样品必须溶于流动相样品必须具有挥发性固定相和流动相均参与分离流动相只用来带动样品，不参加分离分析样品无分子量限定分析样品分子量一般小于500amuStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineeringHPLC与GC的应用差异挥发非挥发疏水性亲水性糖环氧化合物多氯联苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳氢化合物无机离子氨基酸糖类衍生物香精油聚合物单体甘油三酸酯磷脂亚硝胺有机磷杀虫剂酒精多环芳烃芳族胺脂溶性维生素抗体天然食用色素类黄酮抗生素腈类抗氧化剂乙二醇脂肪酸磺胺类挥发性羧酸醛酮类甘草膦合成食用色素苯酚黄曲霉毒素酶糖醇StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering2.色谱方法基本原理色谱的主要理论热力学理论•以相的平衡观点研究色谱过程•塔板理论为代表(Martin&Synge)动力学理论•以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响•VanDeemter方程为代表MartinSyngeStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering分离的原理样品组分在固定相和流动相之间的分配流动相带动样品经过色谱柱不同组分与固定相之间相互作用的强度不同不同组分在固定相上移动速度不同，形成分离分配系数KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]流动相固定相StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering样品组分的分离进样、分配、移动、流出、分离KD2KD1，所以Y先流出來StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering分配系数K分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering样品组分分离情况A.样品与色谱柱固定相无任何作用三种样品在t0时间流出，无保留无保留时间B.样品组分保留时间一致与色谱柱作用力相同C.样品组分保留时间不一致样品各组分与色谱柱作用力不同D.实际分离状况高斯分布曲线StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering色谱出峰形状实际出峰形状为高斯分布曲线(Gaussiancurve)样品的扩散效应无扩散样品扩散StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering分离度分离度（Resolution)两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示：R=?时两峰认为已分开?StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering不同分离度R相邻两吸收峰分离度R=1.0,98%,基线分离R=1.5,99.7%R＞=1.5時，完全分离（中国药典规定）两色谱峰被视为分开StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering分离度R的数学表达分离度R的基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰的保留特性:选择因子(selectivityfactor)反映相邻两色谱峰的分离程度——色谱过程热力学因素N:理论塔板数，反映色谱柱的分离效率(columnefficiency)——色谱过程动力学因素有关R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效选择因子容量因子StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering容量因子k’测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数（量）之比•与温度有关(GC)•与流动相溶剂种类及组成有关(LC)Injectiont0t’RtRStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineeringk’决定样品能进入色谱柱固定相的量k’太小，在固定相上保留太短，很快流出，难以确定保留时间k’太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长，理想的k’为1～5StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering分离效果与k’值的最优化k’值的优化改变溶剂成分、梯度条件(洗脱强度)StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering选择因子色谱柱分开两组份的能力＞1时两组分分离表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。t0t’R1t’R2InjectionStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering选择因子的影响因素影响的因素改变流动相成分，包括改变pH值改变柱温(在LC不明显)改变固定相成分使用特殊化学效应StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering理论板数N塔板理论热力学平衡理论色谱柱效的量化从分馏法技术衍生而来•分离法依组分挥发性不同而分馏•色谱法依组分分配系数不同而分离•分配系数K=Cs/Cm理论板数N、塔板高度H•柱效随N增大和H减小而增加•分配色谱流程模型N=L/HStateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering理论塔板数N与半峰宽W1/2和保留时间的关系如下在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering分离效能的最优化增加容量增加选择因子增加柱效增加k’值可增加分离度但会增加分析时间改变流动相、固定相成分增加值可增加分离度但不能因此影响k’值StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering液相色谱仪设备概述StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering液相色谱仪器组成溶剂传输系统（泵系统）进样系统检测器工作站组分收集（选项）StateKeyLaboratoryofChemicalResourceEngineering液相色谱仪器结构组成示意图流动相储液瓶单元或多元泵梯度混合器预柱手动-进样器自动