液相色谱质谱联用的原理详解

汇报人：XXX2015-12-18液相色谱—质谱联用技术简介•液质联用（LC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。•LC-MS除了可以分析气相色谱-质谱（GC-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点：分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高液质联用与气质联用的区别:气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。LC-MS由以下几部分组成数据及供电系统┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓液相色谱接口质量分析器检测接收器（离子源）┗━━━━━╋━━━━━━┛真空系统真空系统5质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。离子源6离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。1.质谱检测的是离子2.离子源=接口7ESI是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入后端检测。电喷雾电离（ESI）8ESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的有机化合物。ESI的最大特点是容易形成多电荷离子。目前采用电喷雾电离，可以测量大分子量的蛋白质。大气压化学电离源(APCI)9APCI喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。CoronaNebulizerAPCIHPLCinlet+++++10APCI主要用来分析中等极性的化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因，用ESI不能产生足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率，可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子，很少有碎片离子，主要是准分子离子。电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。样品流速：APCI源可从0.2到2ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1ml／min.断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子质量分析器12◆质量分析器是质谱仪的核心,质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列。◆不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱仪。◆不同类型的质谱仪其功能，应用范围，原理，实验方法均有所不同。单聚焦磁场分析器13在一定的B、V下，不同m/z的离子其R不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分离。离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运动。其运动轨道半径R可由下式表示：上式中，m-离子质量Z-离子电荷量V-离子加速电压B-磁感应强度14单双聚焦质谱仪体积大；色谱-质谱联用仪器的发展及仪器小型化（台式）需要体积小的质量分析器：四极杆质量分析器飞行时间质量分析器离子阱质量分析器体积小，操作简单；分辨率中等；15四极杆质量分析器四极杆质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，扫描速度快，适合于GC-MS,LC-MS。+ElectronBeamABCSampleinIonBeam16飞行时间质谱仪（TimeofFlightMS,TOF-MS）TOF-MS的核心部分是一个无场的离子漂移管；加速后的离子具有相同的动能zVmv2212/1)2(mzVvm/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管;m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管。适合于生物大分子，灵敏度高，扫描速度快，结构简单，分辨率随m/z的增大而降低。17FT-MS的核心为分析室，分析室由三对平行的极板构成。磁力线沿z轴方向，离子的回旋运动垂直于z轴，在与x轴方向垂直的两极板上施加激发射频，在与y轴方向垂直的两极板上检测信号。(FourierTransformioncyclotronresonanceMassSpectrometer,FTICR-MS)傅立叶变换离子回旋共振质谱仪离子阱质量分析器18特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；19检测系统质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器,经接收放大后被记录。20质谱仪的检测主要使用电子倍增器，也有的使用光电倍增管。由倍增器出来的电信号被送入计算机储存，这些信号经计算机处理后可以得到色谱图，质谱图及其它各种信息。LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。2.正、负离子模式的选择：选择的一般原则为：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。3.流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5mmol/l。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。4.流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm内径的微柱，TIS源最高允许lml／min，建议使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。5.辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。具体应用领域医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机化学：表面活性剂、染料