液质联用

液质联用(HPLC/MS/MS)液质联用(HPLC/MS/MS)仪器构造HPLC/MS/MS分析测试原理及功能仪器适用范围测试条件的选择谱图分析HPLC/MS/MS示意图(**)自动进样器色谱柱PDA（阵列二极管检测器）离子化室质量分析器检测器液相色谱质谱计算机液质联用仪器结构质谱离子化室液质联用仪器结构四元泵(包括真空脱气机)柱温箱PDA检测器溶剂瓶箱自动进样器液相色谱流程图PUMPDetectorWDatastation(Recorder)orCollection高效液相系统高效液相系统储液罐过滤与脱气装置高压输液泵梯度洗脱装置进样系统1)过滤与脱气装置（**）洗脱液进入高压泵前应充分脱气，不脱气的影响：气泡留在泵中影响泵的正常工作，使洗脱液压力不稳定，增加基线的噪声；洗脱液中溶解的氧能破坏样品，同时氧在190－230nm有弱的吸收，从而减小检测器的灵敏度；当洗脱液流出色谱柱进入检测器样品池时由于洗脱压力下降生成气泡影响检测器的正常工作。常用的脱气方式：低压脱气法；吹氦脱气法；超声波脱气法；在线脱气。在线脱气流动相流经小真空包中的半透膜管路，其中的气体透过半透膜，由真空泵抽走，从而达到脱去流动相中溶解空气的目的。2)梯度洗脱装置当一个样品的混和物的容量因子k范围很宽，等度冲洗时，一则时间太长，二则后面的峰较宽或扁平不便检测，此时选用梯度洗脱冲洗可改善样品的分离度，缩短分析时间，改善峰形和提高样品的最小检测量。a高压梯度洗脱将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度装置。洗脱流量精度高，重复性好，不易产生气泡。混合器B泵A泵梯度程序控制b低压梯度洗脱装置在常压下，按预先设定的比例混合，再由高压泵输入色谱柱。重现性好，精度高，仪器组合简单，但混和前必须高度脱气。混合器高压输液四通分离方法液－固色谱法（liquid-solidchromatography）反相和正相色谱法离子对色谱法离子交换色谱离子色谱法空间排斥色谱亲和色谱法胶束色谱法手性色谱法等HPLC分离原理最广的色谱法是反相色谱主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，因此应用范围很宽。十八烷基（C18）化学键合相是最常用的非极性键合相，反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。因此，分离机制比较复杂。反相色谱分离原理疏溶剂理论：当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生斥力，自由能（G）增加，熵减小，不稳定性增加。根据热力学第二定律，系统不稳定到稳定是自发的。因此，为了弥补熵的损失，溶质分子中的非极性基的取向，将导致在溶剂中形成一个“空腔”，这种效应称为疏溶剂或疏水效应。该理论认为，在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力，而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。反相色谱的流动相反相色谱法的流动相的极性大于固定相，通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相。在反相色谱中，由于固定相是非极性的，所以溶剂的极性增加，分离结构相近的组分时，极性大的组分先出柱。液相色谱的检测方法紫外－可见光检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器电化学检测器化学发光检测器红外光谱检测器等离子化的方法(IonisationMethods)电子轰击电离EI化学离子化CI场电离，场解吸FD快原子轰击FAB基质辅助激光解析电离MALDI电喷雾电离ESI大气压化学电离APCI电喷雾电离源ElectrosprayIonization(ESI)在强电场下溶液带电形成带电液滴带电液滴体积不断缩小（溶剂蒸发，不断发生库仑爆炸）离子逸出表面，蒸发进入空间电喷雾电离的实质：电荷浓缩效应电喷雾电离的实质：电荷浓缩效应电喷雾电离电喷雾电离(ESI)***+++++++++____++++++++++++++++____+++++++++++++++++++++++蒸发带电液滴小液滴ESI离子蒸发机理大气压化学电离源AtmosphericPressureChemicalIonization(APCI)APCI离子化过程1.高电压放电针与载气和溶剂反应产生初级的离子O2+e→O2++2eN2+e→N2++2e2.通过一系列复杂的反应初级离子与溶剂分子反应生成溶剂离子H3O+andCH3OH2+3.溶剂离子与待分析物分子形成(M+H)＋或者(M-H)-H3O++M→(M+H)++H2OOH•+M→(M-H)-+H2O**比较ESIEIAPCI电离源大气压化学电离源**ESI和APCI的异同离子产生的方式1.APCI利用电晕放电离子化，气相离子化。2.ESI利用液相离子化，带电液滴溶剂蒸发形成离子。能被分析的化合物类型不同1.APCI弱极性，小分子化合物，且具有一定的挥发性2.ESI极性化合物和生物大分子。ESI和APCI的异同流速1.ESI0.001到0.25ml/min。2.APCI0.2到2ml/min。多电荷1.APCI不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析大分子。2.ESI能生成一系列多电荷离子，特别适用于蛋白，多肽类等生物分子。都属于软电离方式，能够提供分子量的信息EI离子源质谱图ESI离子源质谱图090905-taoyang-3#39RT:0.55AV:1NL:1.44E7T:+cQ1MS[400.00-1500.00]4005006007008009001000110012001300m/z05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance605.08583.09606.08621.07662.26563.19663.26503.10767.281081.65855.001187.72896.701326.69966.00[M+Na]+[M+K]+[M+H]+MW=582离子源的选择质量分析器将离子源产生的离子按其质量和电荷比（m/z）的不同进行分离，得到按质荷比（m/z）排列而成的质谱图质量分析器的种类很多：有磁质量分析器，四级质量分析器（四级杆滤质器），飞行时间质量分析器，离子阱质量分析器等三重四极杆（串联质谱）TSQ质谱组件QOOQOQ1HyperquadQ3HyperquadQ2CollisionCellDetectionSystemIonSourceInterfaceHeatedCapillaryMassAnalyzerQ1Q3Q2Q0DynodeTurbo仪器主要功能定性分析（混合物）样品中的物质：分子量、分子结构、相对含量定量分析样品中的物质含量精密质量数的测定高分辨质谱进行元素组成分析任何一种同位素的质量并不是正好的整数。▼为了区分这四个离子，测量的质量的准确度需达到130ppm。即小数点后第四位是准确的。▼元素组成信息随着质量的增加而呈指数地上升，对质谱质量的测定准确度要求更高。12C=12.00000000，1H=1.007782506，14N=14.00307407，16O=15.99491475m=43.0184Da的离子必定是C2H3O+，不可能是C3H7+(m=43.0058)或C2H5N+(m=42.9984)，或CH3N2+(m=43.0296)。仪器适用范围仪器配备决定其适用范围液相色谱的条件（色谱柱）离子源的类型仪器测试条件的选择液相色谱条件质谱条件HPLC条件的选择(流动相)根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水（**DMF、DMSO、DCSO、THF）某些化合物只有某种流动相体系才出峰一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，所以恒定比例流动相能满足分离分析要求时，尽量不用梯度，尤其定量分析时流动相的选择流动相中加入甲酸、乙酸等可提高正离子化效率(**)液质联用中，流动相有时需要加入缓冲盐ACH3COONH4BHCOONH4CKH2PO3是否加酸不是绝对的，具体应根据LC的分离情况、样品在酸性条件下的稳定性等决定(**)通常pH值低时，[M+H]+比率高；pH值高时，[M+Na]+、[M+K]+，或[M+NH4]+比率高色谱柱的选择FlowRateColumnI.D.1.0mL/min4.6mm0.5mL/min3.0mm0.2mL/min2.1mm50mL/min1.0mm10mL/minCapillaryLC流速一般根据色谱柱规格和电离方式来确定APCI0.2-2ml/minESI5-300μl/minroutinely(1ml/minpossible)离子化方法选择根据样品性质确定离子化方式适合ESI的样品类型：–高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；–胺类、季铵盐等；–含杂原子化合物如氨基甲酸酯等适合APCI的样品类型：–弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等–含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等ESI不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等；APCI不适合的化合物：非挥发性或热稳定性差的样品ESI离子源的检测条件ESI一般用于极性物质的检测碱性化合物(-NH2)(M+H)+酸性化合物(-CO2H,-OH)(M-H)-正离子方式–分析碱性化合物用有机酸调整pH值如：甲酸或乙酸负离子方式–分析酸性化合物用碱调整pH值如：氨水扫描类型选择Full-ScanMassSpectrometrySingleIonMonitoring(SIM)SelectedReactionMonitoring(SRM)Full-ScanMassSpectrometryAdvantageProvidesMWInformationDisadvantageLowdutycycleScanningPassAllPassAllFull-ScanMSofBuspironeNNNNNOOBuspirone(丁螺环酮)C21H31N5O2MW=385150200250300350400450500m/z255075100RelativeAbundance386408(M+H)+(M+Na)+SingleIonMonitoring(SIM)AdvantagesTargetedAnalyteMonitoringHighDutyCycleSimpleDisadvantagesCansufferfrominterferencesNotassensitiveorselectiveasSRM(seebelow)Fixedm/zPassAllPassAllSelectedReactionMonitoring(SRM)AdvantagesTargetedAnalyteMonitoringHighDutyCycle“Simultaneous”MonitoringofMultipleTransitionsDisadvantageNo“advanced”structuralinformationFixedm/zPassAllFixedm/zQ1Q2Q3操作程序清洗仪器及管路配样（稀释）质谱条件优化（保存方法）液质联用方法设置平衡色谱柱分析结果进样品结果无效液质联用与气质联用的区别气质联用仪(GC-MS)适宜分析小分子,易挥发,热稳定,能气化的化合物;用电子轰击方式(EI)得到的谱图,可与标准谱库对比.液质联用(LC-MS)高沸点，热不稳定及大分子量化合物(包括蛋白,多肽,多聚物等)的分析测定没有商品化的谱库可对比查询,只能自己建库或自己解析谱图离子源主要有：ESI，APCI等液质联用与气质联用的区别液质联用与气质联用的区别HPLCGC几乎可分析各种物质只能分析20%的挥发性物质在室温下分析，可分析热不稳定化和物通常在高