海洋生物制药

主讲人：许东晖梅雪婷中山大学生命科学学院中药与海洋药物研究室海洋生物制药当代新药研究的新思路目前，美国、德国、日本等国家利用人类基因组计划的最新研究成果，将人类重大疾病相关基因克隆于体外细胞表达系统，直接用以快速筛选评价受试物的药理作用。由于直接采用人类疾病相关基因进行药物筛选，可明确活性物质的作用位点和机理，同时可保持药物筛选结果与临床实验的相对一致性，大大降低临床实验的风险性。因此，由于绝大部分陆生的动植物活性成分已获得筛选，科学家转向从海洋生物或原始森林中寻找药用活性成分。美国、欧盟等国家已对红海、地中海等海域的海洋生物进行药物筛选，现对开始转向南海海域的海洋生物资源活性物质的筛选。由于我国对海洋生物资源的保护政策，外国同行主要从越南、菲律宾等国获得南海海洋生物样品，进行快速高效的药物筛选，对具有开发价值的活性物质及结构进行专利保护。钾离子通道与心血管疾病生物膜电位是可兴奋细胞膜内外侧电位的电位差。电位差是由于细胞膜对某些离子的选择性通透而产生的。其静息膜电位一般为-60~-90mV，膜内带负电荷呈负极性。1902年伯恩斯坦（Bernstein）提出神经细胞膜对K+离子有选择性通透的“膜学说”。1952年霍奇金运用电压钳法研究枪乌贼巨大神经纤维上对神经膜在静息和动作电位的离子机制，表明神经膜在静息时仅允许K+从膜内流出，活动时仅允许Na+流进膜内，提出并验证了“钠离子通道学说”。1955年卡斯特罗对神经－肌肉接头突触传递过程的研究发现：突触后膜终板电位发生，是由于神经递质乙酸胆碱（ACh）作用于终板膜上受体的结果，从而确认了受体化学递质调控的通道。1973年和1974年阿姆斯特郎和凯恩斯分别在神经轴突上测量到与离子通道开放相关的膜内电荷运动，称为门控电流，确认了离子通道的开放与膜中离子运动的关联性。电压钳（Voltageclamp）技术：将玻璃微电极插入细胞内，施加一跨膜电压并把膜电位固定于某一数值，即可测定该膜电位条件下离子电流随时间变化的动态过程。利用药物或改变细胞内外的溶液成分，使其它离子通道失效，则可测定被研究的某种离子通道的功能性参数，并能测量和分析通道的门控电流的特性。膜片钳（Patchclamp）技术：又称单通道记录技术。用特制玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10~100G的密封（Gigaseal），被孤立的小膜片面积为m2量级，内中仅少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个通道开放产生的pA（10-12A）量级电流。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放机率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可将吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。膜电位变化的异常导致心律改变，发生心动过速、心律过缓或不齐，统称为心律失常（Arrythmia）。心律失常可分为快速型和缓慢型两类。心律失常均指快速型心律失常，包括心房扑动、心房纤维性颤动、阵发性室上性的心动过速、室上心动过速和过早搏动等。室性心律失常的主要危险是室颤，下列因素参与它的形成：(1)心律失常；(2)心肌缺血；(3)心功能不全；(4)神经因子及电介质不平衡。当心肌缺血时，它在心肌微循环内形成梗塞，加重缺血损害及诱发心律失常。室颤在本质上是由于心肌离子通道的病变，使各个心肌纤维的电活动由同步现象转化为去同步现象，这一过程可能与胞内信息传递系统的改变相关。抗心律失常药根据对心肌电生理的影响和作用机制，可分类4类：I类药物能阻断心肌细胞膜快的通道，抑制4相Na2+内流，降低自律性，不同程度地减慢0相除极和减慢传导。II类药物能阻断心脏的受体，对抗儿茶酚胺类对心脏的作用，降低窦房结、房室结和传导组织的自律性，减慢传导，延长APD和ERP。III类药物主要阻滞心肌钾通道，延长心房肌、心室肌及传导组织的APD和ERP，对自律性无明显影响。IV类药物主要阻滞心肌慢钙通道，抑制胞外Ca2+内流，能减慢房室结的传导，消除房室结的折返。延长(APD及ERP)的药物，可控制心律失常，这些药物均可阻断钾通道。钾通道的种类很多，大致可分为二大类：(1)电压依赖性钾通道瞬时外向钾电流（Ito）：在去极化电流如INa使膜电压改变后，即刻引起Ito出现AP的I相。Ito有2个组分。Ito1，持续时间较短，对4-AP（4-aminopyrine，4-氨基吡啶）敏感。Ito2持续时间较长，为钙所激活。Ito的增强，复极过程加速。相反Ito被抑制，则复极过程延迟。Ito1的相关基因已被克隆出Kv1.2，Kv1.4，Kv2.1，Kv4.2。在病变心脏中，这一钾电流家族的mRNA表达有所改变。快速延迟性整流外向钾电流（IKr）：为快速激活及失活组分，此部分电流对复极的效应，随心率快慢而异。在心率快时IKr较弱，而心率慢时IKr较强，对复极过程的影响更长。在先天性LQTS的患者中，有些由于染色体中的HERG基因的变异而失活。该通道的l~4个亚单位，因遗传变异而使通道蛋白失活，使IKr减少25％－100％。IKr下降，使复极过程延迟，QT间期异常延长，易于诱发严重心律失常，乃至心脏猝死。缓慢延迟整流外向钾电流（IKs）：为，其激活与失活均缓慢。当心肌被去极化后，开始缓慢地激活，随后逐渐增强，到3相的中点达最大值，而后又渐次减少而失活。当心率快时，此部分电流占IK的绝大部分。β受体激活时IKS亦被增强，由于缓慢失活而向4相延伸。IKS是复极过程使膜电流回到复极状态的主要电流。延迟性整流外向钾电流（Ik）：发生在Ito稍后，在整个复极过程中。电流的方向为内向或外向，而整流后总的效应是外向的。Ik流向胞外，使K+外流，心肌细胞快速回复到静息时的膜电位。按照由去极化膜电压的激活速率及失活速率，分为3种：IKr，IKs，IKur。超速延迟性整流钾电流（IKur）：为超速激活组分。心肌在去极化后迅速激活外向钾离子流，时间跨越1，2，3相。它的减弱亦必将使复极延迟。具有不同于经典延迟整流K+电流的快慢成分（IKr和IKs）的特性。IKur主要通过Kv1.5通道，而Kv1.5通道cDNA在人心房的表达比任何其他人体组织都高得多，人心室没有IKur存在CAST的启示与I类抗心律失常药1988年进行了规模较大的抗心律失常药的临床试验，称为CAST（CardiacArrhythmiaSuppressionTrial）。对梗塞后患者，用英卡胺与安慰剂，及氟卡胺与安慰剂相比较。两组中各给药组患者心律失常的发生率几乎降到零，而死亡率却为安慰剂组的2倍。受试药均属IC类，为钠通道阻断剂，虽有很强的抗心律失常作用，但缺乏抗室颤作用。阻断剂对于心肌梗塞后频发复杂室性早博的治疗效果可能差于I类抗心律失常药物，但阻断剂与安慰剂相比，可明显降低病人的再梗塞、猝死和总死亡率。III类药物索他洛尔（Sotalol）对梗塞后病人的室性心律失常疗效优于常用的I类抗心律失常药物，并可降低猝死与总死亡率。以上事实表明抗心律失常药物根据其作用可分为两类：即一类为“抗室性早博药物”，可减少早博，却增加猝死与死亡的危险；而另一类为“抗室颤药物”不但可减少室性早博，也可降低猝死与总死亡率。I类抗心律失常药物属“抗早博”药物，II类（阻断剂）和III类（胺碘酮与索他洛尔）为“抗室颤药物”。胺碘酮（Amiodarone）除有III类作用以外，也有阻断作用，而索他洛尔就是经典的阻断剂。I类和III类抗心律失常药物虽利于房颤转复后窦性心律的维持，但伴有致命性促心律失常的危险。IB或III类药物的作用机制为早期后除极化，而IA或IC类则为阻断钠通道、延迟传导，有利于折返的形成。因此，医药学界致力于寻找新的阻断特殊离子更特异地作用于心房而对心室影响较小的抗心律失常药物，以期发挥抗房颤作用，并且又无I、III类药物的促心律失常作用。钾离子（K+）电流影响动作电位的复极过程，大多数延长动作电位和不应期的药物是通过阻断K+电流起作用的。最近发现人心房内存在的新的K+电流IKur；仅存在于人心房。特异性阻断IKur的药物可望明显延长心房不应期成为真正的特异性抗房性心律失常、不致室性心律大常的新型药物。国外医药公司以IKur电流作为靶电流，以人的心肌细胞作为实验材料进行药物筛选。课题立项的背景钾电流异常是心律失常发生的主要原因之一。当今抗心律失常药物的研究均以钾电流作为靶电流。目前III类抗心律失常药物：胺碘酮(Amiodarone)，对延迟整流K+电流的快慢成分(Ikr和IKs)具有很好的阻滞作用，其疗效较好但毒性较强，可导致肺纤维化、角膜碘沉着及肝肾损害。长期服用易引起甲状腺功能障碍，引发产生新的心律失常。多非利特(Ddfetilide)、伊布利特(Ibutilide),是快速转复房颤和房扑,能选择性阻滞Ikr。但都有共同的副作用，即致心律失常作用，它们有逆频率依赖性效应，心律高时药效降低，心律低时易导致尖端扭转性室性心动过速(Tdp)。现医药公司致力于寻找特异性作用于心房，而对心室影响较小的新型抗心律失常药物，以期发挥抗房颤作用，并且无Ⅰ、Ⅲ类药物的促心律失常作用。Kv1.5基因是编码超速延迟性整流钾电流Ikur离子通道，Ikur在人心房细胞上发现，具有组织特异性，而在心室中不存在。Ikur钾电流的过度表达会造成房颤、房扑等心律失常，可使脑中风发生率增加5-7倍。Kv1.4、Kv4.2基因是编码瞬间外向钾电流Ito离子通道。在心房中较丰富。特异性阻断Ikur的药物可望明显延长心房不应期，成为真正的特异性抗房性心律失常、不致室性心律失常的新型药物。医药公司在开发新型抗心律失常药物时，均以Ikur作为靶电流．并用人新鲜心房细胞作为实验材料。局限:人心肌细胞膜同时存在着多种电流成分，在评价抗心律失常药物对Ikur或Ito作用时往往需要改变细胞膜静息电位水平，使用药物阻断其他电流成分，这种方法往往会影响实验结果。由于必须采用人新鲜的原代人心肌细胞，而继代培养的人心肌细胞，其细胞膜电流成分的各种特性会发生改变。人新鲜心肌细胞较难获得，而且往往是病人的病理细胞，细胞差异较大，不能随时供应，该实验开展局限于拥有临床心脏手术医院的科研单位进行。新型抗心律失常海洋I类新药A1998的研究技术路线：①利用探针提取心肌细胞Kv1.5、Kv1.4、Kv4.2基因mRNA反转录成cDNA③连接至载体(pGM-T等)④转入大肠杆菌⑤扩大培养、提取质粒、转录成mRNA⑥转入生物反应系统(Oocyte)中⑦利用基因钳技术对海洋活性物质微量筛选、构效关系研究、结构修饰、专利保护⑧药理学、毒理学、工业化生产等临床前研究⑨申报并进入临床研究2.心律失常相关基因Kv1.5、Kv4.2、Kv1.4cRNA电泳图谱Marker2604190826041908Kv1.5cRNAKv4.2cRNAKv1.4cRNAMarker图2新化合物A1998对Ikur钾电流及Ito钾电流的作用Fig.2ThefunctionofnewcompoundA1998onexpressionofIkurandItoK+currentpotential/mV-80-60-40-20020406080Kv4.2K+current/uA0123K+currentonoocyteK+currentin50nM/LA1998K+currentin100nML-1A1998K+currentin150nM.L-1A1998potential/mV-80-60-40-20020406080Kv1.5K+current/uA0123k+currentonoocyteK+currentin50nM/LA1998K+currentin100nM/LA1998K+currentin150nM/LA1998表A1998对乌头碱所致大鼠心律失常的预防作用xs,n=10,*P0.05,**P0.01,***P0.001vscontrol室性早